曹小芳 畢曉云 王勇奇 李志勇 陳晶礪 黃 舒 郭子寬 王恒湘

高遷移組蛋白1-A盒對大鼠膠原誘導的關(guān)節(jié)炎的治療作用

曹小芳 畢曉云 王勇奇 李志勇 陳晶礪 黃 舒 郭子寬 王恒湘

目的探討高遷移組蛋白1-A盒（A-box of high mobility group protein-1，A-BOX）對類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用。方法以膠原誘導的關(guān)節(jié)炎（Collagen-induced arthritis，CIA）大鼠模型為研究對象，在膠原造模4周后，進行關(guān)節(jié)炎癥狀評分，并將實驗動物隨機分為三組（每組12只），腹腔內(nèi)分別注射A-BOX（每只大鼠注射0.62 mg，A-BOX組）、甲氨蝶呤（1 mg/Kg，MTX組）和生理鹽水（陰性對照組），每周一次，連續(xù)治療4周。治療后進行關(guān)節(jié)炎癥狀評分、踝關(guān)節(jié)病理學及X線攝片檢查。結(jié)果所有造模大鼠均出現(xiàn)了關(guān)節(jié)炎癥狀，造模后關(guān)節(jié)炎評分為（7.25±0.70），顯著高于正常大鼠（P＜0.01）。治療4周后，陰性對照組癥狀評分為（7.77±0.44），顯著高于MTX組（6.25±1.03）（P＜0.05）和A-BOX組（6.12±0.99）（P＜0.01）。MTX組與A-BOX組無顯著差異（P＞0.05）。病理學顯示，A-BOX組滑膜增生、血管新生和炎癥評分分別為（0.00±0.00），（1.14±0.69）和（1.71±0.75）；MTX組分別為（0.71±0.48），（1.57±0.78）和（1.42±0.53），均顯著低于陰性對照組的（2.28±0.45），（1.85±0.69）和（2.14±0.89）（P＜0.05）。A-BOX組未見滑膜增生，評分低于MTX組（P＜0.05）；兩組間其他改變無顯著差異（P＞0.05）。X線攝片A-BOX組、MTX組及陰性對照組評分分別為（1.85±1.06），（1.85±1.06）和（3.28±0.48），均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。結(jié)論A-BOX對大鼠CIA治療作用稍優(yōu)于MTX，具有藥物開發(fā)前景。

高遷移率族蛋白1-A盒甲氨蝶呤膠原誘導的關(guān)節(jié)炎

類風濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是關(guān)節(jié)滑膜炎癥導致關(guān)節(jié)破壞的慢性全身性疾病[1]，以慢性、進行性、對稱性和多關(guān)節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)[2]，基本病理特征是滑膜組織炎性增生，伴關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的破壞[3]。高遷移率族蛋白B1（High mobility group protein-1，HMGB1）是HMG家族成員之一，廣泛存在于各型細胞的胞核和胞質(zhì)中[4]。研究表明，HMGB1作為一種重要的晚期炎癥介質(zhì)，在多種急慢性炎癥中均有表達[5]，是多種疾病發(fā)生、發(fā)展過程中關(guān)鍵的因素之一[6]。RA的突出細胞學特征為細胞壞死和巨噬細胞活化[7]?；颊哐獫{中可檢測到高水平HMGB1，是受累關(guān)節(jié)滑膜液中單核巨噬細胞在致炎因子刺激下釋放HMGB1，同時受HMGB1刺激而釋放致炎因子，構(gòu)成炎癥放大效應的結(jié)果。HMGB1主要由A-BOX、B-BOX及酸性尾端組成，其中BBOX具有促炎作用，A-BOX可以拮抗HMGB1的炎性作用[8]。我們既往的研究表明，A-BOX可以抑制T淋巴細胞增殖，也可促進間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化[9]。由此設想，利用A-BOX拮抗HMGB1的致炎效應可能成為RA治療的新策略。為此，我們建立膠原誘導關(guān)節(jié)炎（Collagen-induced arthritis，CIA）大鼠模型，與甲氨蝶呤（Methotrexate，MTX）比較，觀察ABOX的治療效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及來源

Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量140～180 g（軍事醫(yī)學科學院提供），動物置于恒溫、恒濕的安靜飼養(yǎng)室內(nèi)分籠飼養(yǎng)，每籠3只，標準飼料喂養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑

免疫純牛Ⅱ型膠原（Chondrex公司）。弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑（Sigma公司）。MTX（澳法瑪西亞公司）。A-BOX（本室純化）經(jīng)鑒定合格后-20℃儲存?zhèn)洚f[9]。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠CIA模型的制備

按本實驗室方法制備大鼠CIA模型[9]。將牛Ⅱ型膠原（2 mg/mL）與福氏完全佐劑等體積混勻并乳化，取0.5 mL在大鼠背部、尾根部及足墊多點皮內(nèi)注射。1周后，將Ⅱ型膠原與弗氏不完全佐劑等體積混勻并乳化，取0.5 mL同上多點注射進行加強免疫。4周后，將大鼠隨機分為3組，每組12只，腹腔內(nèi)分別注射A-BOX（每只大鼠0.62 mg，A-BOX組）、甲氨蝶呤（1 mg/Kg，MTX組）和生理鹽水（陰性對照組），每周1次，連續(xù)治療4周。4周后處死所有大鼠，取大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)行X線攝片及病理切片觀察關(guān)節(jié)損傷情況。

1.2.2 CIA大鼠模型的評價

關(guān)節(jié)炎嚴重程度以平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)（Arthritis index，AI）評價[9]，0級：無紅腫；1級：局限于足或踝關(guān)節(jié)的輕度紅腫；2級：足趾至踝關(guān)節(jié)的輕度紅腫；3級：足趾至踝關(guān)節(jié)中度紅腫；4級：踝關(guān)節(jié)至整個腿紅腫或關(guān)節(jié)畸形，活動受限。

1.2.3 病理學評分

所有大鼠取踝關(guān)節(jié)，經(jīng)固定、脫鈣、石蠟包埋后連續(xù)切片，行HE染色，顯微鏡下觀察組織病理表現(xiàn)，由病理科醫(yī)生參照以下標準進行關(guān)節(jié)病理評分：根據(jù)炎癥細胞浸潤、侵蝕性血管翳、滑膜增生程度3項指標，每項按輕重程度評為0～3分（0分：無改變；1分：輕度；2分：中度；3分：重度）。

1.2.4 X線評分

所有大鼠取右后肢，甲醛固定后，對右后踝進行X線攝片（電壓60 KV，電流7 mA，曝光0.04 ms）。踝關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞程度由?？漆t(yī)師，用Larsen評分標準進行單盲評分。具體標準為[9]：0分為正常；1分為輕度異常，包括一處或多處關(guān)節(jié)周圍軟組織腫脹，骨質(zhì)疏松和輕微關(guān)節(jié)間隙狹窄；2分為明確的早期異常，包括明顯骨質(zhì)侵蝕改變、有或沒有關(guān)節(jié)間隙狹窄；3分為輕度關(guān)節(jié)破壞伴關(guān)節(jié)間隙狹窄程度小于正常的50%；4分為重度關(guān)節(jié)破壞，關(guān)節(jié)間隙狹窄程度大于正常的50%，但未消失；5分為多個關(guān)節(jié)殘毀，關(guān)節(jié)間隙消失。

1.2.5 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用Excel 2010和SPSS 17.0醫(yī)學統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)炎癥狀評分

實驗第3周，大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度均達高峰，之后腫脹趨于穩(wěn)定或略有降低，在第4周時均已穩(wěn)定。模型動物關(guān)節(jié)炎評分為7.25±0.70，顯著高于正常大鼠（0.00±0.00）（P＜0.01）。治療4周后，陰性對照組癥狀評分為（7.77±0.44），顯著高于MTX組（6.25± 1.03）（P＜0.05）和A-BOX組（6.12±0.99）（P＜0.01）。MTX組與A-BOX組無顯著差異（P＞0.05）（圖1）。

圖1 各組大鼠后肢大體觀。Fig.1Representative hind abnormality of the rats in different groups

2.2 病理學分析及評分

踝關(guān)節(jié)HE染色觀察顯示，健康大鼠滑膜無增生，無血管翳形成，未見炎性細胞浸潤，關(guān)節(jié)表面光滑無破壞。陰性對照組和MTX組踝關(guān)節(jié)均可見滑膜層增生、新生血管形成、炎細胞浸潤、軟骨和骨破壞，而A-BOX組未見滑膜增生但可見新生血管形成和炎細胞浸潤（圖2）。

圖2 治療4周后大鼠踝關(guān)節(jié)病理觀察Fig.2Representative histological observation of rat ankle joints 4 weeks after treatment

病理切片評分發(fā)現(xiàn)，所有健康大鼠滑膜和關(guān)節(jié)評分均為0級，A-BOX組滑膜增生、血管新生和炎癥評分為（0.00±0.00），（1.14±0.69）和（1.71±0.75）；MTX組為（0.71±0.48），（1.57±0.78）和（1.42±0.53），均顯著低于陰性對照組（2.28±0.45），（1.85±0.69）和（2.14±0.89）（P＜0.05）。A-BOX組未見滑膜增生，評分低于MTX組（P＜0.05）；兩組間其他改變無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)果提示，A-BOX對CIA的治療作用略優(yōu)于MTX。

2.3 大鼠踝關(guān)節(jié)X線的分析

踝關(guān)節(jié)X線片單盲評分，A-BOX組、MTX組和陰性對照組分別為（1.85±1.06），（2.14±0.37）和（3.28±0.48），組間差異顯著（P＜0.05）。提示，A-BOX對大鼠CIA的治療作用優(yōu)于MTX（圖3）。

圖3 各組踝關(guān)節(jié)X線改變Fig.3Typical X-ray films of rats ankles in each group

3 討論

類風濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性全身反應性的自身免疫性疾病，目前尚無特效治療藥物，甲氨喋呤（MTX）做為RA的一線治療藥，可以有效減輕類風濕關(guān)節(jié)炎的炎癥癥狀，并且可以預防或減少骨質(zhì)的侵蝕和破壞，但因副作用明顯而限制了其臨床使用。我們的既往研究表明，A-BOX單體與HMGB1類似，具有抗炎性反應和促成骨分化作用的雙重性，為類風濕關(guān)節(jié)炎的治療提供了新的方向。

有研究表明[10]，HMGB1蛋白是一種晚期促炎因子，胞外的HMGB1可以促進成血管細胞的遷移和增殖。在RA患者和CIA模型動物的滑膜組織中，HMGB1的表達均明顯增強，血清中HMGB1明顯增多，且巨噬細胞分泌促炎因子，如TNF-a和IL-1的水平明顯增高。為探討A-BOX對類風濕性關(guān)節(jié)炎治療的作用，本實驗以CIA大鼠模型為研究對象，與常用藥物MTX比較，觀察A-BOX的治療效果。實驗結(jié)果表明，CIA大鼠腹腔注射A-BOX拮抗HMGB1蛋白表達，可以減輕大鼠的骨質(zhì)破壞和滑膜增生，且病理和X線檢查結(jié)果均優(yōu)于MTX的療效。

A-BOX拮抗HMGB1蛋白的具體機制尚未明確，但根據(jù)本實驗結(jié)果，我們推測，A-BOX進入大鼠體內(nèi)與HMGB1受體結(jié)合，抑制巨噬細胞分泌TNF-a和IL-1等促炎因子分泌，減輕炎癥刺激，抑制成血管細胞的遷移和增殖，進而達到減輕滑膜增生的效果。另外，利用A-BOX單體治療，可以通過加強關(guān)節(jié)腔內(nèi)間充質(zhì)干細胞的促成骨作用，加速骨組織損傷的修復，以達到治療RA的目的。

本實驗為類風濕關(guān)節(jié)炎的治療提供了一個全新的方向，但是仍有許多問題亟待解決，如臨床單用重組純化的A-BOX治療RA能否取得令人滿意的效果？異體來源純化的A-BOX應用于人體內(nèi)是否會產(chǎn)生副作用？怎樣才能實現(xiàn)體內(nèi)有效給藥？而關(guān)于A-BOX拮抗HMGB1蛋白的具體機制亦仍需大量研究來深入明確地進行闡述。

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Therapeutic Effect of A-BOX Domain of High Mobility Group-1 on Rat Arthritis Induced by Collagen

CAO

Xiaofang1*,BI Xiaoyun2*,WANG Yongqi1,LI Zhiyong3,CHEN Jingli2,HUANG Shu2,GUO Zikuan3,WANG Hengxiang1.1 Department of Hematology,General Hospital of Air Forces,Beijing 100036,China;2 Department of Biological Diagnosis and Therapy,Guangzhou Hospital of Developmental District,Guangzhou 510730,China;3 Department of Experimental Hematology,BeijingInstituteofRadiation,Beijing100850,China.Correspondingauthor:WANGHengxiang (wanghengxiang123@yahoo.com.cn).*These authors contributed equally to this work.

ObjectiveTo investigate if A-box domain of human high mobility group protein-1(A-BOX)could exhibit beneficial effects on rheumatoid arthritis.MethodsRat arthritis model was developed by four-week injection of collagen (collagen-induced arthritis,CIA),followed by scoring on arthritis symptoms and dividing at random into three groups that received peritoneal injection of A-BOX at a dose of 0.62 mg per rat(A-BOX group,n=12),methotrexate(MTX group,n=12) at a dose of 1 mg/Kg or saline(control group,n=12)respectively.Each group contained 12 rats and the injections were performed weekly for four consecutive weeks.Scoring of symptoms and pathological and X-ray examinations on the ankle knees were performed after treatment.ResultsThe results showed that arthritis symptoms occurred in all the tested rats andthe scoring(7.25±0.70)was significantly higher than that of healthy controls(0.00±0.00,P＜0.01).After four-week therapy, the symptom scores in control group were 7.77±0.44,greatly higher than those in MTX group(6.25±1.03,P＜0.05)and ABOX group(6.12±0.99,P＜0.01).Meanwhile,there was no difference between MTX group and A-BOX group(P＞0.05). Pathological examination revealed that the scores of synovial hyperplasia,new blood vessel formation and inflammation in ABOX group were 0.00±0.00,1.14±0.69 and 1.71±0.75 respectively,and those in MTX group were 0.71±0.48,1.57±0.78 and 1.42±0.53,all the parameters of which were significantly lower than those in control group(2.28±0.45,1.85±0.69,2.14±0.89, P＜0.05).Furthermore,the scoring of synovial hyperplasia in A-BOX group was lower than that in MTX group(P＜0.05),while there were little difference on the other two parameters between these two groups(P＞0.05).Scoring on X-ray results showed that rats in A-BOX group(1.85±1.06)restored better than rats in MTX group(2.14±0.37),which was lower than that of control group(3.28±0.48).ConclusionA-BOX could exhibit more beneficial effect on CIA rat than MTX,enhancing the possibility of its application in clinical trials.

A-box of high mobility group protein-1;Methotrexate;Collagen-induced arthritis

R593.22

A

1673－0364（2013）03－0137－04

2013年4月23日；

2013年5月15日）

國家自然科學基金（30971068）；國家863課題（2011AA020101）；廣州開發(fā)區(qū)科技局課題（2009Q-P081，2010QP035）。

100036北京市中國人民解放軍空軍總醫(yī)院血液科（曹小芳，王勇奇，王恒湘）；510730廣東省廣州市廣州市經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)醫(yī)院（畢曉云，黃舒，陳晶勵）；100850北京市軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所實驗血液學研究室（李志勇，郭子寬）。

王恒湘（Email：wanghengxiang123@yahoo.com.cn）。

注：曹小芳、畢曉云為共同第一作者。

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.03.005