孫 楠 張 群

表皮干細胞抽提物重編程脂肪干細胞表達表皮細胞表型的實驗研究

孫 楠 張 群

目的研究富集的表皮干細胞（Keratinocytes enriched with epidermal stem cells,KSC）抽提物對重編程人脂肪干細胞（Adipose derived stem cells,ASCs）表達表皮細胞表型的影響。方法常規(guī)方法收集表皮細胞（Keratinocytes,KC）后，應用Ⅳ型膠原差速貼壁法分別收集KSC與富集后剩余的表皮細胞（Keratinocytes enriched with epidermal stem cells left,KCL），鑒定K19和P63的陽性表達率，Gimsa染色法測定KC、KSC、KCL的克隆形成率，分別制備KC、KSC、KCL的細胞抽提物，作用于鏈球菌溶血素-O（SLO）通透處理過的原代ASCs，分別應用流式細胞儀與Western-blot測定重編程后ASCs中廣譜角蛋白（Pan cytokeratin,P-CK）與ASCs的BRG1表達變化。結果KSC與KC、KCL來源的細胞抽提物重編程ASCs的CK及BRG1表達率，均有明顯統(tǒng)計學差異（P<0.01）。結論脂肪干細胞在表皮細胞抽提物的誘導作用下能表達表皮細胞表型，且對表皮細胞優(yōu)化處理后的KSC有更加顯著的重編程作用。

表皮干細胞脂肪干細胞重編程細胞抽提物

細胞重編程技術是近年來研究的熱點，重編程能使細胞表型轉化為目的細胞表型[1]，細胞抽提物重編程的優(yōu)勢在于制備獲取過程簡單，重復性好[2]。自體脂肪組織作為活性移植物在外科組織重建與美容修復等方面應用廣泛[3]，而脂肪干細胞在特定的條件下具有多向分化潛能和自我增殖的特性，來源豐富、取材容易、創(chuàng)傷小。使用脂肪干細胞作為種子細胞，通過細胞重編程的方法誘導其表達表皮細胞表型，可以解決臨床供體細胞不足的問題，如大面積皮膚缺損導致供皮區(qū)不足。目前，關于表皮細胞抽提物重編程脂肪干細胞的相關研究較少，因此，我們擬對來源于表皮干細胞的抽提物對脂肪干細胞重編程效果進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），胰蛋白酶（Gibco公司，美國)，胎牛血清（FBS，Hyclone公司，美國），膠原酶NB4（Serva公司，德國），細胞裂解液（Sigma公司，美國），溶血鏈球菌素（Streptolysin，SLO；Sigma公司，美國），細胞乳化超聲破碎儀（上海比朗儀器有限公司，中國），ATP生成體系（Sigma公司，美國），GIS22800型凝膠圖像處理系統(tǒng)（上海天能科技公司）。流式直標抗體:FITC-廣譜角蛋白抗體（Pan cytokeratin antibody，Anti-P-CK），F(xiàn)ITC-角蛋白19（FITC-Cytokeratin19，CK19），PE-P63小鼠單克隆抗體（Santa Cruz公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 表皮干細胞的分離培養(yǎng)

取皮膚組織（來源我科上瞼或下瞼手術切除的健康皮膚，供者年齡為30～46歲，獲患者知情同意），先用D-Hank's液洗2次，浸入含青霉素、鏈霉素的平衡鹽溶液30 min，無菌條件下徹底清洗，去除皮下組織及部分真皮，將皮膚剪切成約0.5 cm寬的皮條，0.5%DispaseⅡ消化，4℃過夜；吸棄上清，分離表皮和真皮層，將表皮剪碎，加0.25%胰蛋白酶消化，37℃、5%CO2條件下孵育15 min，用含血清培養(yǎng)基終止消化，過150目不銹鋼濾網(wǎng)篩，收集濾液，1 000 r/min離心5 min；棄上清，用人表皮干細胞培養(yǎng)基重新懸浮細胞（KC），吹打成單細胞懸液，錐蟲藍染色，以2.0×106cells/mL接種于預先鋪有人胎盤Ⅳ型膠原的培養(yǎng)瓶內，37℃5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育15 min后，吸出培養(yǎng)液及未貼壁細胞（KCL），用未加血清的培養(yǎng)基洗2次，留在培養(yǎng)皿內的細胞（KSC）加入KSFM表皮干細胞培養(yǎng)基，隔天半量換液，以后2～3 d換液1次，光鏡下觀察細胞生長情況。

留在培養(yǎng)瓶內的細胞為富集的表皮干細胞（KSC），吸出的未貼壁細胞為富集后剩余表皮細胞（KCL），未分選的表皮細胞為常規(guī)方法收集的表皮細胞（KC）。

1.2.2 脂肪干細胞的分離培養(yǎng)

無菌條件下取脂肪抽吸術后的腹部脂肪組織，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，以除去紅細胞和細胞碎片。清洗后加入等體積0.1%的Ⅱ型膠原酶，37℃恒溫搖床消化2 h后，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液和漂浮的脂肪細胞，獲得高密度的細胞沉淀物。用含有10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素penicillin，鏈霉素streptomycin）的DMEM培養(yǎng)液重懸后，以1×106cells/cm2的細胞密度接種于10 cm培養(yǎng)皿內。本實驗所用ADSCs為培養(yǎng)的原代細胞。

1.2.3 流式細胞儀檢測

收集待測細胞懸液，1 000 r/min離心5 min；棄上清，1%多聚甲醛室溫固定30 min，用10%FCS DMEM調整細胞濃度為5×106～1×107cells/mL，取200 μL細胞懸液加入離心管，行細胞角蛋白19 (K19)（1:50）和P63（1:100）流式細胞儀分析，記錄觀察數(shù)據(jù)。

1.2.4 克隆形成率測定

將培養(yǎng)的KSC、KC和KCL分別分散成單細胞懸液，按200個/孔接種到培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。2周后Gimsa染色，顯微鏡下觀察。進行細胞克隆計數(shù)，并計算克隆形成率（克隆形成率(%)=細胞克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%）。

1.2.5 表皮細胞抽提物制備

收集到的表皮細胞用PBS清洗2次后離心，棄上清后加入預冷的細胞裂解液。細胞懸液用脈沖超聲勻漿化，直至光鏡下觀察不到細胞結構。4℃15 000 r/min離心15 min，提取上層蛋白質溶液，分裝于凍存管中，迅速于液氮中冷凍1 min,放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 抽提物加入鏈球菌溶血素O滲透處理ASCs

取原代培養(yǎng)的ASCs，于冰冷的PBS中洗滌2遍后，分裝于1.5 mL的EP管中，4℃下1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，加入濃度為230 ng/mL的SLO溶液。每100 μL SLO溶液中平均1×105個細胞。將細胞置于37℃水浴中50 min，每隔15 min重懸1次。50 min后，離心收集細胞。每1×105個細胞加入100 μL抽提液和ATP生成體系（1 mmolATP，10 mmol磷酸肌酸，25 μg/mL肌酸激酶及ATP、CTP、GTP、UTP各1 mmol/L），37℃水浴箱中孵育1 h，每20 min重懸1次。此過程中，抽提液中成分進入ASCs內。孵育結束后，加入含10%FBS的DMEM（含有2 mmol的CaCl2），放置于37℃水浴中2 h，以封閉胞膜孔道。離心后加入表皮培養(yǎng)液混勻，接種于培養(yǎng)皿上。24 h換液，以后每3天換液1次。

1.2.7 Western-blot方法檢測

取KSC、KC和KCL抽提物重編程的ASCs，RI-PA裂解液裂解細胞，BCA法進行蛋白質濃度測定，取20 μg等量蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），免疫印跡法檢測BRG1蛋白表達變化。1.2.8統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 被分選的KSC、KC和KCL細胞的CFE觀察（Gimsa染色）

KSC的克隆形成團塊多于KC和KCL（圖1），顯微鏡下觀察計數(shù)，計算細胞克隆形成率（圖2）。KSC、KC和KCL的CFE分別為：30.08%±4.29%；5.12%±3.03%；0.78%±0.66%（P<0.01）。

圖1 KSC、KC和KCL細胞克隆形成情況大體觀察Fig.1The observation of clone forming of KSC,KC and KCL

圖2 KSC、KC和KCL的克隆形成率Fig.2Cloning forming efficiency of KSC,KC,and KCL

2.2 被分選的KSC、KC和KCL細胞表型流式鑒定

流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)（圖3），KSC、KC和KCL中K19＋細胞表達率分別為93.28%±3.11%、23.12%± 3.82%和7.83%±2.29%（P<0.01)；KSC、KC和KCL中P63＋細胞表達率分別為90.67%±5.52%、18.87%± 2.21%和3.01%±1.07%（P<0.01)。

2.3 三組表皮細胞抽提物重編程ASCs的CK表達的流式鑒定

經(jīng)過KSC、KC和KCL抽提物誘導后，CK在ASCs中的表達量分別為13.31%±4.29%、5.66%±3.11%和0.89%±0.19%（圖4）。

2.4 三組表皮細胞抽提物重編程ASCs的BRG1表達

非溶解型BRG1在KSC,、KC和KCL中的蛋白質表達強度分別為1.83%±0.27%、0.76%±0.14%和0.07%±0.05%。可見重編程效應在KSC抽提物誘導組最強（圖5）。

圖3 流式細胞儀檢測被分選的KSC、KC和KCL的K19、P63的表達Fig.3K19 and P63 expression of KSC,KC,and KCL detected by flow cytometry

圖4 流式細胞儀檢測三組來源的細胞抽提物重編程的ASCs的廣譜角蛋白抗體-FITC的表達Fig.4The expression of cytokeratin(CK)changes of ASCs reprogrammed by different keratinocyte extracts

圖5 三組表皮細胞抽提物作用下ASCs中BRG1的表達Fig.5The expression of BRG1 of ASCs reprogrammed by cell extracts of KSC,KC,and KCL

3 討論

細胞抽提物介導的重編程是體細胞重編程的一種方法，不同于經(jīng)典的核移植或細胞融合[4-7]的重編程方法。細胞抽提物重編程的目的，是使已經(jīng)分化的體細胞轉分化為另一種細胞類型，或者去分化為多能干細胞狀態(tài)[1，8]。已經(jīng)有許多文獻顯示，細胞抽提物重編程模式被證實是一種有效模式[9-12]。實驗中所制備的細胞抽提物的成分為細胞質和細胞核的可溶解部分，不包括染色質[13]。目前，細胞抽提物誘導重編程后的細胞與目的細胞僅形態(tài)上相近，或者具有相似的細胞表型及功能，并不能確定必然完全分化至同種細胞。細胞抽提物重編程的機制尚不明確，可能與目的基因啟動子的組蛋白H3、H4乙?；ɑ蚣谆┖虳NA甲基化有關，引起決定細胞特性的基因轉錄上調、活化或下調[8]，從而改變受體細胞形態(tài)。

在成人的表皮基底層中存在大量干細胞（KSC)，部分有絲分裂為子代細胞，還有部分以短暫擴增細胞(TA)形式存在，共同參與角質化過程。表皮干細胞具有慢周期性和巨大的增殖潛能[14]。人體正常皮膚中的KSC相對靜止，主要功能是分裂增殖維持表皮的自然更替；皮膚組織損傷時愈合創(chuàng)面[15]。KSC在體外培養(yǎng)的條件下仍能保持干細胞特性，即自我更新和增殖分化潛能；而普通的表皮細胞離開體內環(huán)境后不可避免得發(fā)生終末分化[16]。因此，體外培養(yǎng)研究中，表皮干細胞相對普通表皮細胞有更大的優(yōu)勢，將表皮干細胞分選出來可能成為優(yōu)化實驗條件的因素。

用細胞外基質成分Ⅳ型膠原分選表皮干細胞。14 d觀察到KSC組細胞貼壁聚集成團較為明顯，而KC組和KCL組的細胞數(shù)目明顯少于KSC組（P<0.01），換液后染色，可見KSC組細胞克隆形成明顯，細胞伸展良好，密度適中；KC組細胞較分散，聚集成團較少；KCL組少量細胞貼壁，幾乎沒有克隆形成。說明富集方法收集的表皮干細胞（KSC）的分裂增殖能力最強，分選后剩余細胞（KCL）的增殖能力差，未分選的表皮細胞（KC）介于兩者之間，具有一定的體外增殖能力。

K19起初被認為在毛囊的隆起區(qū)域特定表達。近年來發(fā)現(xiàn)，在人毛囊的隆起區(qū)域的最外層根鞘和鄰近區(qū)域也有表達，是決定細胞向表皮細胞表型分化的重要表面標志分子[17，19]。核轉錄因子P63是腫瘤抑制基因P53的同族產(chǎn)物，對表皮組織的發(fā)育、分化、形態(tài)發(fā)生具有重要作用，主要在表皮干細胞、TA細胞、基底層或接近基底層的表皮細胞或毛囊細胞中高表達，終末分化的表皮細胞中的表達量低[18-19]。KSC、KC和KCL均有K19和P63表達，其中KSC的K19和P63的陽性細胞表達率最高。

廣譜角蛋白抗體是上皮細胞特異性抗體，免疫熒光染色后，流式細胞儀檢測三組重編程后的ASCs。KSC組誘導的ASCs的CK表達率最高，說明該組細胞抽提物重編程后的ASCs的表皮細胞化最明顯。

BRG1是細胞重編程過程中的關鍵物質。人類BRG1基因定位于染色體19p上，BRG1基因組共由35個外顯子和34個內含子構成，基因編碼的蛋白質相對分子量為205 KD[20]。文獻報道，BRG1參與轉錄的多個環(huán)節(jié)，如識別被修飾的DNA結合蛋白，作為SWI／SNF復合體的核心酶成分介導招募染色質結構重塑、參與轉錄激活、轉錄抑制和基因沉默[21]。SWI／SNF復合體能夠使DNA從核小體部分解離，并使八聚體移動和改變核小體結構，但該復合體如何靶向特異性促進之而產(chǎn)生轉錄活化因子的機制暫時還不清楚[22]。Bultman等[23]發(fā)現(xiàn)，哺乳動物的染色質結構重塑對于合子基因組活化中重編程基因的表達有至關重要的作用。本實驗中，收集3組細胞抽提物誘導作用下的重編程脂肪干細胞，通過Western-Blot的方法，檢測各組BRG1蛋白的表達量，KSC組的BRG1的表達量最多，提示KSC抽提物的重編程效應最強。

綜上所述，細胞抽提物重編程由于能改變已經(jīng)分化的細胞的命運，使其重回多能干細胞狀態(tài)或者轉分化為另一種細胞類型，為組織工程學研究提供了新的方法。但細胞抽提物重編程還有許多基礎問題沒有解決，比如重編程的具體機制，重編程效率低等。在現(xiàn)有的研究條件下，抽提物介導的重編程效應短暫且不穩(wěn)定[24]。重編程后對受體細胞的基因轉錄調控的持續(xù)時間，以及表達新表型的穩(wěn)定性的問題是未來研究的熱點。盡管和胚胎干細胞（ESCs）以及多能干細胞（iPSCs）相比，ASCs作為一種成體干細胞的分化潛能有所限制[25]，但是ASCs由于易獲取、具備多向分化潛能、增殖能力強的優(yōu)點，已經(jīng)成為臨床應用和實驗研究中的熱點，以ASCs為基礎的干細胞研究將為今后解決臨床實際問題帶來新辦法。表皮干細胞相對普通表皮細胞有強大的增殖分化能力，通過Ⅳ型膠原差速貼壁法能夠穩(wěn)定有效地分離出表皮干細胞[26]。實驗表明，表皮細胞抽提物能誘導脂肪干細胞向表皮細胞表型分化，而富集方法收集的表皮干細胞抽提物的重編程效應較對照組有顯著差異，這可能和表皮干細胞抽提物內的某些物質加速了重編程的進程有關，具體機制有待進一步探明。

[1]Collas P,Taranger CK.Epigenetic reprogramming of nuclei using cell extracts[J].Stem Cell Rev,2006,2(4):309-317.

[2]劉輝,黎江,劉新垣,等.細胞提取物介導的體細胞重編程[J].細胞生物學雜志，2008年05期.

[3]Aguena M,Fanganiello RD,Tissiani LA,et al.Optimization of parameters for a more efficient use of adipose-derived stem cells in regenerative medicine therapies[J].Stem Cells Int.2012;2012: 303610.

[4]Gurdon JB,Byrne JA.The first half-century of nuclear transplantation[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(14):8048-8052. [5]Wakayama T,Perry AC,Zuccotti M,et al.Full-term developmentof mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei[J].Nature,1998,394(6691):369-374.

[6]Tada M,Takahama Y,Abe K,et al.Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells[J].Curr Biol, 2001,11(19):1553-1558.

[7]Do JT,Han DW,Scholer HR.Reprogramming somatic gene activity by fusion with pluripotent cells[J].Stem Cell Rev,2006,2 (4):257-264.

[8]Collas P,Taranger CK.Epigenetic reprogramming of nuclei using cell extracts[J].Stem Cell Rev,2006,2(4):309-317.

[9]Hakelien AM,Landsverk HB,Robl JM,et al.Reprogramming fibroblasts to express T-cell functions using cell extracts[J].Nat Biotechnol,2002,20(5):460-466.

[10]Gaustad KG,Boquest AC,Anderson BE,et al.Differentiation of human adipose tissue stem cells using extracts of rat cardiomyocytes[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,314(2):420-427.

[11]Hakelien AM,Gaustad KG,Collas P.Transient alteration of cell fate using a nuclear and cytoplasmic extract of an insulinoma cell line[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,316(3):834-841.

[12]Rajasingh J,Lambers E,Hamada H,et al.Cell-free embryonic stem cell extract-mediated derivation of multipotent stem cells from NIH3T3 fibroblasts for functional and anatomical ischemic tissue repair[J].Circ Res,2008,102(11):e107-117.

[13]唐新杰,謝峰,宋楠,等.人表皮細胞抽提物重編程脂肪干細胞的實驗研究[J].組織工程與重建外科,2011,7(3):129-132.

[14]揭彬,羅向東,伍素華,等.皮膚組織工程中人表皮干細胞的體外培養(yǎng)及分化特性研究[J].中國臨床康復,2004,8(2):220-222.

[15]Watt FM,Jensen KB.Epidermal stem cell diversity and quiescence [J].EMBO Mol Med,2009,1(5):260-267.

[16]Watt FM.Stem cell fate and patterning in mammalian epidermis變化，必要時行血管探查挽救移植的組織瓣[6]。

參考文獻

[1]Gopal S,Majumder S,Batchelor AG,et al.Fix and flap:the radical orthopaedic and plastic treatment of severe open fractures of the tibia[J].J Bone Joint Surg Br,2000,82(7):959-966.

[2]裘華德.負壓封閉引流技術[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:23-83.

[3]Weed T,Ratliff C,Drake DB.Quantifying bacterial bioburden during negative pressure wound therapy:Does the wound VAC enhance bacterial clearance clearance[J]?Ann Plast Surg, 2004,52(3):276-279.

[4]李靖,陳紹宗,李學擁.等.封閉負壓引流對創(chuàng)面微循環(huán)超微結構影響的實驗研究[J].中國實用美容整形外科雜志,2006,17(1): 75-77.

[5]陳紹宗,曹大勇,李金清,等.封閉負壓引流技術對創(chuàng)面愈合過程中原癌基因表達的影響[J].中華整形外科雜志,2005,21(3):197-200.

[6]楊運發(fā),徐中和,侯之啟,等.監(jiān)測皮島在多種深部移植組織瓣血供監(jiān)測中的應用[J].中國修復重建外科雜志,2006,20(10):1059-1060.[J].Curr Opin Genet Dev.2001 Aug;11(4):410-7.

[17]Lyle S,Christofidou-Solomidou M,Liu Y,et al.Human hair follicle bulge cells are biochemically distinct and possess an epithelial stem cell phenotype[J].J Investig Dermatol Symp Proc,1999,4(3): 296-301.

[18]Reis-Filho JS,Torio B,Albergaria A,et al.p63expressionin normal skin and usual cutaneous carcinomas[J].J Cutan Pathol, 2002,29(9):517-523.

[19]Abbas O,Richards JE,Yaar R,et al.Stem cell markers(cytokeratin 15,cytokeratin 19 and p63)in in situ and invasive cutaneous epithelial lesions[J].Mod Pathol,2011,24(1):90-97.

[20]Trotter KW,Archer TK.The BRG1 transcriptional coregulator[J]. Nucl Recept Signal,2008,6:e004.

[21]屈悅,鄧辰亮,鄭江紅,等.Brg1在細胞重編程中作用的研究進展[J].組織工程與重建外科,2011,7(6):344-347.

[22]Peterson CL,Workman JL.Promoter targeting and chromatin remodeling by the SWI/SNF complex[J].Curr Opin Genet Dev, 2000,10(2):187-192.

[23]Bultman SJ,Gebuhr TC,Pan H,et al.Maternal BRG1 regulates zygotic genome activation in the mouse[J].Genes Dev,2006,20 (13):1744-54.

[24]Bru T,Clarke C,McGrew MJ,et al.Rapid induction of pluripotency genes after exposure of human somatic cells to mouse ES cell extracts[J].Exp Cell Res,2008,314(14):2634-2642.

[25]Mizuno H,Tobita M,Uysal AC.Concise review:Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine[J]. Stem Cells,2012,30(5):804-810.

[26]劉虎仙,賈赤宇,付小兵,等.重復利用Ⅳ型膠原以差速貼壁法分選表皮干細胞[J].中國臨床康復,2006,13:38-40.

（收稿日期：2013年3月6日；修回日期：2013年4月15日）

Research of Reprogramming of Adipose Derived Stem Cells to Express Keratinocyte Phenotype Using Cell Extracts of Keratinocyte Stem Cells

SUN Nan,ZHANG Qun.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:ZHANG Qun(Email:qunzhang737@sina.com).

ObjectiveTo evaluate the role of the cell extracts of keratinocyte stem cells(Keratinocytes enriched with epidermal stem cells,KSC)express keratinocytes phenotype of reprogramming of the adipose derived stem cells(Adipose derived stem cells,ASCs).MethodsKeratinocytes(KC)were collected in conventional methods,then KSC were isolated from KC with differential attachment to recycled collagenⅣand KCL were gathered by not attached cells in suspension culture solution.Clone forming efficiency(CFE)of KC,KSC,KCL were detected with Gimsa staining methods.Cell extracts of KC,KSC and KCL were prepared respectively.Primary cultured adipose derived stem cells were permeabilized using streptolysin O(SLO),and then incubated with cell extracts.Flow cytometry and western-blot were used to detect the expression of pan cytokeratin(Pan cytokeratin,CK)and Brahma-related Gene 1(BRG1)of reprogrammed ASCs.ResultsCell extracts of KSC comparing with that of KC and KCL,had a statistically significant difference（P<0.01）in reprogramming of ASCs with high expression of CK and BRG1.ConclusionAdipose derived stem cells could be induced to express keratinocyte phenotype with cell extracts of keratinocytes,and optimized keratinocyte stem cells have superiority of reprogramming ability.

Keratinocyte stem cells;Adipose derived stem cell;Reprogramming;Cell extracts

Q813.1+1

A

1673－0364（2013）03－0129－05

2013年2月10日；

2013年3月5日）

200011上海市上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科。

張群（電子郵箱：qunzhang737@sina.com）。

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.03.003