朱丹丹，李秋紅

(1.四平衛(wèi)生學(xué)校 口腔教研室，吉林 四平136000;2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 口腔科，遼寧 大連116011)

牙體粘結(jié)在現(xiàn)代口腔粘結(jié)學(xué)領(lǐng)域中，尤其是牙體美學(xué)修復(fù)方面占有非常重要的地位，例如牙體貼面、全冠粘結(jié)、纖維樁應(yīng)用等都涉及到牙體粘結(jié)。牙體粘結(jié)包括牙釉質(zhì)粘結(jié)和牙本質(zhì)粘結(jié)。關(guān)于正常牙本質(zhì)粘結(jié)的實驗研究多有報道，但實際臨床遇到的牙本質(zhì)粘結(jié)很多是針對硬化性牙本質(zhì)的。所以，本實驗擬選用臨床常用的且具有代表性的全酸蝕粘結(jié)系統(tǒng)，將復(fù)合樹脂粘結(jié)于不同性質(zhì)的牙本質(zhì)表面，采用TEM 觀察粘結(jié)界面的微觀形態(tài)，并利用微拉伸測試方法對其粘結(jié)強度進行測試，希望為臨床研究提供幫助和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗用離體牙:選擇2010年上半年在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科17 例患者因牙周病而拔除的磨牙20 顆，牙合面具有典型硬化性牙本質(zhì)，視覺分級三級以上(根據(jù)North Carolina dentine sclerotic scale［1］)為實驗組。另選擇8 例患者因正畸減數(shù)而拔除的前磨牙20 顆，根尖孔已形成為對照組。

使用超聲潔治器去除所有新鮮樣本牙的菌斑和牙石，離體牙在1%氯胺溶液中4 ℃存放，拔除后1個月內(nèi)使用。

1.1.2 實驗材料和設(shè)備:全酸蝕處理系統(tǒng):35%磷酸(3M ESPE，美國)、Single Bond 粘結(jié)劑(3M 公司，美國)、復(fù)合樹脂Z350 (3M USA)、光固化機(Dentsply，Germany)、透射電鏡(TEM 2000EX Jap)、微拉伸測力儀(Bisco，USA)、電子游標(biāo)卡尺(上海臺海工量具有限公司)、低速切割鋸(北京中興百瑞技術(shù)有限公司)、超聲波潔牙機 (EMS France)。

1.2 實驗方法

1.2.1 全酸蝕粘結(jié)處理:將具有正常牙本質(zhì)的20顆前磨牙頜面牙釉質(zhì)在流水下用金剛砂車針磨除，暴露其平整的表層牙本質(zhì)后用全酸蝕處理，即對照組;20 顆磨牙頜面均為硬化性牙本質(zhì)，稍稍打磨平整后直接用全酸蝕處理，即實驗組。處理方法為:經(jīng)35%磷酸酸蝕粘結(jié)面20 s，蒸餾水加壓沖洗20 s，然后用無油氣槍輕輕吹走牙本質(zhì)表面多余水分，但保持表面濕潤。Single Bond 粘結(jié)劑均勻涂布在粘結(jié)面上，停留10 s 后，用氣槍輕輕將粘結(jié)劑均勻吹平展開，然后再涂一層粘結(jié)劑，將過多粘結(jié)劑用小毛刷吸出，光固化燈照射20 s。再用可見光固化復(fù)合樹脂Z350 修復(fù)牙冠至4 ～5 mm 高。修復(fù)過程中應(yīng)用分層固化技術(shù):第一層厚約1.5 mm，后兩層每層厚約1.25 mm，每層均光照60 s。

將粘結(jié)后每一個牙體沿與牙長軸平行的方向分成兩部分，一半用于TEM 觀察實驗試件制備，另一半用于微拉伸粘結(jié)強度測試試件制備。

1.2.2 TEM 觀察實驗試件制備:將樣本用金剛砂車針磨小，牙本質(zhì)部分有粘結(jié)面、有牙本質(zhì)暴露面。將樣本置于含有41.3 g/L EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)和4.4 g/L NaOH 的水溶液中脫礦24 h［2］。用含有2. 5 %戊二醛的0. 1 mmol/L 二甲基砷酸鈉緩沖液(pH 7.4)在4 ℃時固定12 h;0.1 mmol/ L 二甲基砷酸鈉緩沖液沖洗1 min;7% 鋨酸后固定;50 %、75 %、95 %、100 %酒精各10 min 梯度脫水;1∶1 無水酒精和環(huán)氧樹脂中浸透1 h 后用100 %環(huán)氧樹脂再浸透3 h，環(huán)氧樹脂包埋，真空狀態(tài)下去除氣泡15 min;60 ℃恒溫箱聚合48 h。半薄切片厚度約為1 μm，甲苯胺藍染色后光鏡下定位;超薄切片厚度為90 nm;醋酸鈾染色8 min，檸檬酸鉛染色3 min。用TEM 對試件進行微觀結(jié)構(gòu)的觀察。

1.2.3 微拉伸粘結(jié)強度測試試件制備:粘結(jié)完成后的牙齒置于37℃蒸餾水中儲存24 h 后，包埋于自凝樹脂中，沿與牙長軸平行的方向，用慢速鋸垂直于粘結(jié)界面切開，切成粘結(jié)面積為1.2 mm ×1.2 mm，高為8 mm 的數(shù)個長方體微拉伸試件。

1.2.4 微拉伸粘結(jié)強度測試:對實驗組和對照組各隨機選取20 例試件進行微拉伸強度測試。用氰基丙烯酸粘合劑固定于微拉伸測試儀上，加載速度選擇為1 mm/min，直至試件斷裂后記錄載荷峰值(N)，準(zhǔn)確測量每個試件粘結(jié)面的實際面積(mm2)。根據(jù)微拉伸粘結(jié)強度(MPa)計算公式MPa = N/mm2，得出結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 11.5 軟件做兩個獨立樣本t檢驗進行分析，檢驗水準(zhǔn)為:雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 TEM 對粘結(jié)界面形態(tài)的觀察結(jié)果

全酸蝕處理后，實驗組可見大部分區(qū)域牙本質(zhì)與粘結(jié)劑粘結(jié)緊密無縫隙，牙本質(zhì)小管內(nèi)可見鈣化鹽充盈物，見圖1;部分區(qū)域可見粘結(jié)劑成層排列，且出現(xiàn)分離現(xiàn)象，見圖2。對照組部分區(qū)域可見牙本質(zhì)小管內(nèi)有充盈物，見圖3。部分區(qū)域還可見牙本質(zhì)與粘結(jié)劑之間有碎裂，結(jié)合不緊密，見圖4。對照組與實驗組大部分區(qū)域牙本質(zhì)小管內(nèi)相對干凈，全景未見明顯滲入牙本質(zhì)內(nèi)的樹枝狀突起。

2.2 微拉伸實驗粘結(jié)強度

硬化性牙本質(zhì)組微拉伸實驗粘結(jié)強度(38.43 ±2.28)，與正常牙本質(zhì)組(40.55 ±4.34)比較較低，差異有顯著性意義(P ＜0.05)。

圖4 正常牙本質(zhì)組TEM 圖像(×5 000)Fig 4 TEM of sound dentine group (×5 000)

3 討 論

3.1 硬化性牙本質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)特點

硬化性牙本質(zhì)是結(jié)構(gòu)和組成隨著增齡、齲病、磨耗等因素發(fā)生了生理及病理改變的牙本質(zhì)，主要指牙本質(zhì)小管中沉積了鈣化鹽結(jié)晶體，堵塞了牙本質(zhì)小管，這可導(dǎo)致其內(nèi)在水的含量減少。由于牙本質(zhì)粘結(jié)表面經(jīng)酸蝕脫礦后，膠原纖維網(wǎng)暴露，正常情況下混雜在牙本質(zhì)無機質(zhì)中并交叉呈網(wǎng)狀的膠原纖維，此時基本上由牙本質(zhì)表面的水分來支持其蓬松的結(jié)構(gòu)。膠原纖維網(wǎng)中的空隙成為親水性粘結(jié)單體向下方牙本質(zhì)滲透的必需通道。如果這一通道暢通，粘結(jié)劑充分向牙本質(zhì)表面和牙本質(zhì)小管中滲透，并進入到脫礦后的牙本質(zhì)側(cè)枝小管中，即可形成較厚的混合層和完整的樹脂突起［3］。而現(xiàn)在硬化性牙本質(zhì)內(nèi)含水量減少，那么這一通道就不通暢，即牙本質(zhì)通透性大大下降，阻止粘結(jié)劑的滲透，導(dǎo)致樹脂突形成也減少，這些是使其粘結(jié)強度下降的最主要原因［4］。本實驗顯示硬化性牙本質(zhì)經(jīng)全酸蝕粘結(jié)處理后與正常牙本質(zhì)比較，混合層厚度有差異，樹脂突差異不明顯?？赡苁且驗橛不匝辣举|(zhì)通透性大大下降，內(nèi)在水的含量也減少，阻止了粘結(jié)劑和樹脂滲透。而表面塌陷的膠原纖維網(wǎng)也不利于有機溶劑的揮發(fā)，從而使有機溶劑中的水分去除不充分，使得粘結(jié)界面中粘結(jié)性單體的密度降低，所以沒有形成明顯的樹脂突;且牙本質(zhì)小管中又沉積了鈣化鹽充盈物，增加了對酸的抵抗性，樹脂突形成就更少了。

3.2 對牙本質(zhì)的處理方法不同的影響

臨床常用于牙本質(zhì)粘結(jié)的處理方法很多，而本實驗中采用的是步驟多的傳統(tǒng)的三步法全酸蝕粘結(jié)劑。經(jīng)全酸蝕粘結(jié)系統(tǒng)處理的牙本質(zhì)，管間牙本質(zhì)脫礦，膠原纖維微孔支架暴露，同時牙本質(zhì)小管開放，底膠潤濕并滲入膠原纖維間的微孔及牙本質(zhì)小管，這有利于粘結(jié)劑的隨后滲入，且底膠和粘結(jié)劑在原位固化后，即與牙本質(zhì)膠原纖維形成相互扣鎖的混合層，內(nèi)含有許多樹脂突［5］，這成為產(chǎn)生牙本質(zhì)粘結(jié)力的主要來源［6］。

本實驗中所用到的離體牙均4℃下儲存于1%氯胺溶液中1 個月內(nèi)，這種儲存方法能夠有效地殺滅微生物，還不影響牙本質(zhì)的滲透性［7］。

3.3 透射電鏡(TEM)對牙本質(zhì)形態(tài)的觀察

在這種電子顯微鏡中，圖像細(xì)節(jié)的對比度是由樣品的原子對電子束的散射形成的，由于電子需要穿過樣本，因此要求樣本必須非常薄，通常切片的厚度是40 ～50 nm，因為太厚電子束不能穿透，而難以在電鏡下獲得清晰的圖像。制片過程中是需要脫礦的，如果在不脫礦的情況下，同時又要求樣本切片很薄，這點往往很難實現(xiàn)，導(dǎo)致制片困難加大，成本過高。而且在制備樣品過程中要求樣本充分脫水干燥和包埋，使混合層底部收縮，樹脂突受到損害，從而影響觀察結(jié)果的真實性;也可能是TEM 本身觀察范圍小，制片小，因為固定液滲透速率緩慢，樣品體積一般在1 mm3左右，以防樣品過大而其中心部位得不到良好的固定所以制片要小。而實際上需要大面積觀察才能找到更多樹脂突;而且實驗中試件的數(shù)量足夠多才能增加結(jié)果的可信度。本實驗也證實了這幾點。

鑒于樣品制備難度及成本等因素，一般多用SEM 觀察粘結(jié)界面，且關(guān)于SEM 的報道也很多，而本實驗卻選用了較少使用的TEM 來觀察，目的是利用TEM 分辨率比SEM 高，可以針對同一微區(qū)位置進行形貌、晶體結(jié)構(gòu)、成分(價態(tài))做全面分析，希望為臨床操作提供科學(xué)依據(jù)。

3.4 微拉伸粘結(jié)強度測試

微拉伸實驗檢測拉伸強度的測試方法自創(chuàng)建以來被廣泛應(yīng)用于牙本質(zhì)粘結(jié)實驗。它要求粘結(jié)面積＜2 mm2，所以它的破壞方式中沒有內(nèi)聚力的破壞，全是界面破壞，應(yīng)力分布均勻，多數(shù)學(xué)者采用其評估牙本質(zhì)粘結(jié)劑的真實粘結(jié)強度［8］。Hass V 將一步法自酸蝕粘結(jié)系統(tǒng)作用于牙本質(zhì)表面，其強度與粘結(jié)系統(tǒng)相關(guān)［9］。同時也要注意標(biāo)本易折斷和脫水干燥，會影響最終結(jié)果。本實驗中得出的結(jié)果均在30MPa 以上，說明此種方法能夠很好地檢測牙本質(zhì)粘結(jié)強度，優(yōu)點顯著，可作為常用方法之一在檢測中應(yīng)用。

牙本質(zhì)粘結(jié)修復(fù)后的臨床保持率的高低仍需要大量的臨床調(diào)查來隨訪跟蹤，仍需要實驗證實和進一步地探討。

4 結(jié) 論

3M Single Bond 全酸蝕系統(tǒng)處理正常牙本質(zhì)與硬化性牙本質(zhì)后與復(fù)合樹脂粘結(jié)均可形成清晰混合層，硬化性牙本質(zhì)的混合層較薄;在本實驗條件下，與正常牙本質(zhì)相比，硬化性牙本質(zhì)與復(fù)合樹脂的微拉伸粘結(jié)強度較低。

［1］ Kusunoki M，Itoh K，Hisamitsu H，et al. The efficacy of dentine adhesive to sclerotic dentine［J］.J Dent，2002，30:91 -97.

［2］ Agee K.Effects of acids and additives on the susceptibility of human dentine to denaturation［J］.J Oral Rehabilitation，2000，27(1):136 -141.

［3］ 李瀟，施長溪，趙信義，等.牙本質(zhì)表面狀態(tài)對粘結(jié)界面影響的激光掃描共聚焦顯微鏡研究［J］. 實用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，21(1):71 -74.

［4］ Kwong SM，Cheung G，Kei LH，et al. Micro-tensile bond strengths to sclerotic dentin using a self-etching and a total-etching technique［J］. Dent Mater，2002，18(5):359 -369.

［5］ Kinney JH，Balooch M，Marshall SJ，et al.Atomic force microscope measurements of the hardness and elasticity of peritubular and intertubular dentin［J］. J Biom engineering，1996，118:133 -135.

［6］ 鄭鐵麗，黃翠，張智星.5 種牙本質(zhì)粘結(jié)系統(tǒng)粘結(jié)強度的比較［J］.口腔醫(yī)學(xué)，2009，29(11):582 -585.

［7］ 于玲，王曉燕. 牙本質(zhì)粘結(jié)劑粘結(jié)強度與界面形態(tài)的研究［J］. 實用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2009，25(4):467 -470.

［8］ 任英華，周彩濱，杭曉東，等.冷熱刺激對牙本質(zhì)粘結(jié)劑拉伸強度的影響［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2006，35(2):164 -165.

［9］ 于清華，翟月明，潘杏蘭.四種黏結(jié)劑對牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)微拉伸黏結(jié)強度的比較［J］. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2006，16(19):2922 -2924，2927.