金河田，王曉旭，樸豐源

(1.沈陽(yáng)202醫(yī)院 放射治療中心，遼寧 沈陽(yáng) 116001；2.大連醫(yī)科大學(xué) 勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

亞慢性砷暴露對(duì)小鼠海馬組織細(xì)胞凋亡的影響

金河田1，王曉旭2，樸豐源2

(1.沈陽(yáng)202醫(yī)院 放射治療中心，遼寧 沈陽(yáng) 116001；2.大連醫(yī)科大學(xué) 勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

目的觀察亞慢性砷暴露致小鼠海馬組織細(xì)胞凋亡作用，為探討砷的神經(jīng)毒性作用機(jī)制提供依據(jù)。方法昆明種小鼠40只，按體重將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、1 ppm、2 ppm 和4 ppm 三氧化二砷 (As2O3) 染毒組。通過(guò)自然飲用含不同濃度As2O3水的方式使小鼠砷暴露，連續(xù)染毒60 d。取海馬組織，通過(guò)HE染色觀察海馬組織形態(tài)學(xué)變化，通過(guò)TUNEL和Hoechst雙染以及透射電鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡。結(jié)果與對(duì)照組相比，染毒組小鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，細(xì)胞核仁增多，細(xì)胞分布稀疏、排列紊亂。電鏡下，可觀察到染毒組小鼠的海馬細(xì)胞出現(xiàn)膜皺縮，核仁消失，染色質(zhì)凝聚、移動(dòng)，分布于核周，進(jìn)而裂解成幾個(gè)碎片等凋亡細(xì)胞形態(tài)特征。TUNEL和Hoechst雙染色分析結(jié)果顯示，在染毒組小鼠海馬切片可見凋亡染色陽(yáng)性細(xì)胞，其凋亡指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，且隨著染毒劑量的增高而增多。結(jié)論亞慢性砷暴露可導(dǎo)致小鼠海馬組織細(xì)胞凋亡。

三氧化二砷；海馬；凋亡；神經(jīng)毒性

砷的中樞神經(jīng)毒性日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn), 長(zhǎng)期飲用含砷水的兒童記憶力、注意力及語(yǔ)言能力均有不同程度的下降[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，長(zhǎng)期染砷后大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力顯著低于對(duì)照組[2]。海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位, 亦是毒物作用的敏感部位, 多種毒物誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生凋亡均會(huì)造成學(xué)習(xí)記憶能力的損害[3]，然而砷暴露是否誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡文獻(xiàn)報(bào)道不多。本研究主要觀察亞慢性砷暴露對(duì)小鼠海馬組織細(xì)胞損傷及誘導(dǎo)凋亡的影響。通過(guò)三氧化二砷(As2O3)染毒小鼠制作亞慢性砷中毒動(dòng)物模型，采用HE染色觀察砷對(duì)海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)影響。用透射電鏡方法及TUNEL和Hoechst雙染法觀察染砷小鼠海馬神經(jīng)元發(fā)生凋亡情況，為探討砷的學(xué)習(xí)記憶損傷毒性機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

三氧化二砷 (As2O3)(上?；瘜W(xué)試劑廠)；In Situ Cell Death Detection Kit(羅氏，德國(guó))；Recombinant DNase I(寶生物工程有限公司，中國(guó))；Triton X-100 (Sigma，美國(guó))；枸櫞酸鹽(天津制藥廠，中國(guó))；防猝滅封片劑(碧云天生物有限公司，中國(guó))，Hochest 染色劑(Sigma，美國(guó))，TCS - SP2激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica，德國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

SPF級(jí)昆明小鼠40只，雌雄各半，體重 (20±2)g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK(遼)2008-0002。小鼠按體重隨機(jī)分為 4 組，每組10只。即對(duì)照組、1 ppm As2O3染毒組、2 ppm As2O3染毒組、4 ppm As2O3染毒組。將不同濃度的As2O3溶解于飲用水中，通過(guò)自然飲用含不同濃度As2O3蒸餾水方式使小鼠暴露于As。飼養(yǎng)小鼠的室內(nèi)條件如室溫 (22±2)℃、濕度 (60±5)%等被嚴(yán)格監(jiān)控，小鼠可以任意飲水和取食(標(biāo)準(zhǔn)食物)，連續(xù)染毒60 d。

1.3 HE染色觀察

對(duì)照組和染毒組小鼠各3只，將小鼠用戊巴比妥納(200 mg/kg)在腹腔處麻醉，經(jīng)4%多聚甲醛溶液(pH7.4)灌流2 h。將用多聚甲醛固定后的海馬組織浸入石蠟中，從海馬中間部分開始以5 μm厚度切片，進(jìn)行HE染色，鏡下觀察海馬組織形態(tài)學(xué)改變。Olympus顯微鏡下觀察照相。

1.4 透射電子顯微鏡觀察

取對(duì)照組和染毒組小鼠各3只，脫頸處死，在冰上迅速取出大腦，放在潔凈的培養(yǎng)皿上，快速分離出海馬，將海馬修整成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，放入預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液中(4 ℃，pH7.4)固定2 h，然后取出組織塊，用緩沖液漂洗后改用1%鋨酸固定液固定2 h(4 ℃，pH7.4)。固定完后，進(jìn)行丙酮梯度脫水。將組織常規(guī)包埋在多孔橡膠包埋模板中，修成小塊，超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，H-7500型透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，并拍照。

1.5 TUNEL-Hoechst凋亡雙染色

對(duì)照組和染毒組小鼠各4只，將小鼠用戊巴比妥納(200 mg/kg)在腹腔處麻醉，經(jīng)4%多聚甲醛溶液(pH7.4)灌流2 h。將小鼠置于冰上，取出腦組織，快速分離海馬組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定。將固定好的組織進(jìn)行石蠟包埋，切片機(jī)進(jìn)行切片，每片5 μm厚，貼片待用。TUNEL染色采用 In Situ Cell Death Detection Kit(羅氏，德國(guó))試劑盒，主要步驟：將切好的切片進(jìn)行脫蠟浸水，將切片浸入到新配的孵育液中(0.1% Triton X-100, 0.1% sodium citrate)，25 ℃，8 min。切片浸入TUNEL反應(yīng)混合液中孵育，37 ℃，60 min；之后用Hoechst 33342 (2 mg/mL) 染色20 min。最后，用防猝滅封片劑封片，4 ℃，暗室，放置12 h，然后于共聚焦顯微鏡下檢測(cè)，并拍照。40倍光鏡下，隨機(jī)選擇10個(gè)視野并計(jì)數(shù)1000個(gè)海馬神經(jīng)元細(xì)胞，記錄凋亡細(xì)胞數(shù)。計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，AI=(凋亡細(xì)胞數(shù)/1000)×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料的組間差異，采用χ2分析，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠海馬細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)照組海馬神經(jīng)元細(xì)胞邊緣清晰，細(xì)胞核呈圓形、橢圓形，染色質(zhì)在核內(nèi)分布較均勻，核仁清晰(見圖1A)。而各染毒組可見海馬神經(jīng)元分布稀疏、排列紊亂，膜邊緣欠清晰，胞漿可見空泡變性，核固縮或碎裂，其中尤以4 ppm As2O3組最為嚴(yán)重(圖1B，C，D)。

2.2 透射電鏡觀察小鼠海馬細(xì)胞凋亡

電鏡下，對(duì)照組小鼠海馬細(xì)胞核膜核仁清晰可見，核內(nèi)染色質(zhì)均勻分布(圖2A)。而在染毒組小鼠的海馬組織可見凋亡細(xì)胞，細(xì)胞皺縮，核膜尚完整，核仁消失，染色質(zhì)凝聚、移動(dòng)，分布于核周，進(jìn)而裂解成幾個(gè)碎片(圖2C，D)。

2.3 TUNEL-Hoechst染色觀察小鼠海馬細(xì)胞凋亡

TUNEL-Hoechst凋亡染色觀察顯示，對(duì)照組和1 ppm As2O3染毒組在視野下幾乎見不到陽(yáng)性細(xì)胞(圖3A，B)。2 ppm As2O3染毒組小鼠海馬切片中發(fā)現(xiàn)極少數(shù)的陽(yáng)性細(xì)胞(圖3C)，而高劑量4 ppm As2O3染毒組海馬切片中，可見較多的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，有的散在分布，有的集中分布，凋亡細(xì)胞較多(圖3D)。各染毒組小鼠海馬細(xì)胞的凋亡指數(shù)分別為1 ppm組4.23±1.08,2 ppm組11.23±3.31，4 ppm組28.39±4.36，均顯著高于對(duì)照組0.23±0.08，P<0.01；且隨著染毒劑量的增高而增多(圖4)。

圖1 染砷小鼠海馬細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)變化(HE×200)

圖2 染砷小鼠海馬凋亡細(xì)胞的透射電鏡觀察 (× 100 000)

圖3 TUNEL-Hoechst染色觀察染砷小鼠海馬細(xì)胞凋亡

圖4 凋亡指數(shù)分析

3 討 論

砷是一種分布廣泛的環(huán)境污染物，人體主要通過(guò)飲用含砷濃度超標(biāo)的水以及職業(yè)的途徑砷暴露[4]。目前全世界估計(jì)近5 700萬(wàn)人飲用的地表水中所含砷超過(guò)WHO所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，而中國(guó)是受砷中毒危害最為嚴(yán)重的國(guó)家之一[5]。砷暴露可引起多器官系統(tǒng)的疾病，其中砷致神經(jīng)系統(tǒng)損害而影響兒童記憶力及學(xué)習(xí)能力的問題尤其得到人們的高度關(guān)注。

細(xì)胞凋亡也稱為程序性細(xì)胞死亡，是一種由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程。在一定程度上, 細(xì)胞凋亡對(duì)生物體維持自身穩(wěn)定具有重要作用，而細(xì)胞凋亡調(diào)控失常常參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展。砷與細(xì)胞凋亡聯(lián)系密切，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞發(fā)生凋亡，使組織喪失正常生理功能。陳偉等[6]發(fā)現(xiàn)，慢性砷染毒可誘發(fā)生精細(xì)胞凋亡，張韻等[7]發(fā)現(xiàn)，砷可通過(guò)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致肝臟損傷。有研究報(bào)道，在染砷大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元和小腦神經(jīng)元觀察到具有凋亡特征性的形態(tài)學(xué)改變[8]。海馬結(jié)構(gòu)與生物的學(xué)習(xí)記憶有密切關(guān)系, 其結(jié)構(gòu)和功能的完整性對(duì)生物保持正常學(xué)習(xí)記憶有重要作用。本實(shí)驗(yàn)光鏡和電鏡觀察結(jié)果顯示，亞慢性砷暴露引起海馬神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生異常形態(tài)學(xué)改變，同時(shí)發(fā)生凋亡細(xì)胞數(shù)增多并隨染砷劑量的加大而增加。本研究結(jié)果提示，亞慢性砷暴露可誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)元發(fā)生凋亡。砷的誘導(dǎo)凋亡作用很可能是慢性砷暴露導(dǎo)致兒童出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶下降的重要機(jī)制之一。

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Effectofsubchronicexposuretoarseniconapoptosisofhippocampuscellsinmice

JINHe-tian1,WANGXiao-xu2,PIAOFeng-yuan2

(1.CentreofRadiotherapy,the202HospitalofShenyang,Shenyang116001,China; 2.DepartmentofOccupationalandEnvironmentalHealth,CollegeofPublicHealth,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

ObjectiveTo examine the apoptosis of hippocampus cells in mice exposed to arsenic (As) subchronically and to provide evidences for exploring the mechanism of As-induced neurotoxicity.MethodsForty mice were divided into 4 groups of 10 each. Group 1

drinking water alone (control). Group 2, 3 and 4 received 1 ppm, 2 ppm and 4 ppm As2O3respectively. As2O3was given through drinking water. On the 60th day after As2O3exposure, mice were decapitated and the hippocampus was taken. Pathomorphological changes of hippocampus tissue were observed by optical microscope. Apoptosis of hippocampus cells was also examined by electron microscopy and TUNEL-Hoechst.ResultsCompared with control, swelling of hippocampus cells, sparse of cell distribution and disorder of cell arrangement where foswhd. Under transmission electron microscopy, some neurons in mice exposed to As showed a shrunken cellular membrane, diminished cell body and increased delectron density of nuclear chromatin. The apoptosis indices of the hippocampal neuron in the mice exposed to As were significantly higher than those in controls (P<0.01).ConclusionThe subchronic exposure to As may induce apoptosis of hippocampus cells in mice.

As2O3; hippocampus; apoptosis; neurotoxicity

10.11724/jdmu.2013.03.02

R114

A

1671-7295(2013)03-0214-04

金河田，王曉旭，樸豐源.亞慢性砷暴露對(duì)小鼠海馬組織細(xì)胞凋亡的影響[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,35(3)：214-217.

國(guó)家自然科學(xué)基金(30571584)

金河田(1960-)男，遼寧沈陽(yáng)人，副主任醫(yī)師。

樸豐源，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：piaofy_dy@yahoo.com.cn

2013-02-18；

2013-03-21)