姜 歡 欒 陽 張 慧

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600

掌葉半夏的HPLC指紋圖譜研究

姜 歡 欒 陽 張 慧

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600

目的：采用高效液相色譜法建立掌葉半夏的HPLC色譜指紋圖譜分析方法，為其品質(zhì)控制提供可靠依據(jù)。方法：采用HPLC－UV分析掌葉半夏的指紋圖譜。色譜柱：Kromasil ODS－C18（4.6mm×200mm，5μm）流動(dòng)相：水（A）－甲醇（B），線性梯度洗脫。體積流量：1.0ml/min。柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。檢測(cè)波長260nm。測(cè)定7批掌葉半夏指紋圖譜，應(yīng)用相似度分析、系統(tǒng)聚類分析，對(duì)掌葉半夏進(jìn)行分類研究。結(jié)果：在色譜指紋圖譜中，確定了13個(gè)共有峰，根據(jù)相似度分析、系統(tǒng)聚類分析的結(jié)果，將7批藥材分為2類。結(jié)論：該方法方便，重現(xiàn)性好，可用于掌葉半夏的質(zhì)量控制。

掌葉半夏；指紋圖譜；聚類分析

掌葉半夏為天南星科半夏屬植物掌葉半夏Pinellia pedatisecta Schott的干燥塊莖，有燥濕化痰、祛風(fēng)止痙、消腫散結(jié)之功效。其主要化學(xué)成分有生物堿［1］、甙類、二肽類、氨基酸等［2］。臨床上應(yīng)用于宮頸癌治療［3］。藥材混淆品眾多，質(zhì)量控制指標(biāo)尚無明確規(guī)定。為此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC對(duì)不同產(chǎn)地的7批藥材進(jìn)行了指紋圖譜的研究，建立掌葉半夏較為科學(xué)全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 藥材 7批不同產(chǎn)地藥材由安國杏林藥材公司和河北光明藥材有限公司提供，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定為掌葉半夏的塊莖。見表1。

表1 樣品編號(hào)及來源

1.2 儀器與試藥 Agilent HPLC1100液相色譜儀，AT－330恒溫柱箱、蒸餾水、甲醇、腺苷對(duì)照品。

1.3 色譜條件與適用性試驗(yàn) 色譜柱：Kromasil ODS－C18（4.6mm×200mm，5μm）

流動(dòng)相：A：水，B：甲醇。線性梯度5min，A－B（90：10）；3min，A－B（90：10）；20min，A－B（86：14）；30min，A－B（10：90）；35min，A－B（0：100）；55min，A－B（0：100）。

流速：1.0m l/min。檢測(cè)波長260nm。

柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。

記錄時(shí)間：75min。

理論塔板數(shù)不低于2500。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試品溶液的制備 取掌葉半夏藥材粉3g（過3號(hào)篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇25m l，精密稱定重量，超聲提取30min，放冷，稱重，加30%甲醇補(bǔ)足減失的重量，0.45μm微孔濾膜濾過，即得。2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取腺苷對(duì)照品7.91mg，置200ml量瓶中，加30%甲醇適量使其溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 測(cè)定方法 分別取對(duì)照品及供試品溶液經(jīng)微孔濾膜后，分別精密吸取10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 檢測(cè)波長的確定 取樣品溶液，分別在215、254、260、300nm處檢測(cè)。結(jié)果表明，215nm處基線飄移，300nm各色譜峰之間分離度不好，且峰數(shù)不足10個(gè)，254、 260nm峰數(shù)基本相近，但254nm基線不穩(wěn)定，不能準(zhǔn)確積分，為此確定選用260nm為檢測(cè)波長。

3.2 參照物的確定 測(cè)定了7個(gè)不同產(chǎn)地掌葉半夏藥材樣品，藥材的色譜峰均在60min之內(nèi)出現(xiàn)，由于對(duì)照品腺苷為已知成分，且其為活性成分，其色譜峰在34min左右，不同產(chǎn)地7個(gè)樣品均存在，因此選擇此峰為參照物峰。

3.3 共有指紋峰的標(biāo)定 同時(shí)測(cè)定了未加掌葉半夏平行制備的陰性樣品溶液，對(duì)陰性液與供試品色譜圖進(jìn)行了比較，排除了陰性干擾峰，以34min出現(xiàn)峰（腺苷）為參照物，選擇7個(gè)產(chǎn)地藥材中保留時(shí)間與參照物相對(duì)比的相對(duì)保留時(shí)間一致的峰為共有指紋峰，最終確定共有指紋峰13個(gè)，經(jīng)計(jì)算，7個(gè)產(chǎn)地的各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜3%，每個(gè)產(chǎn)地色譜圖中的共有峰的峰面積之和大于90%。見表2。

表2 掌葉半夏藥材指紋圖譜共有峰的峰號(hào)

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 精密度試驗(yàn) 由三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)人員，精密吸取同一供試品溶液10μL，在色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算共有指紋峰與參照物的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果RSD均小于3.0%，表明精密度良好。

3.4.2 穩(wěn)定性考察 精密吸取供試品溶液10μL，分別在0、2、4、6、8、10h不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，以上述各共有指紋峰為檢測(cè)指標(biāo)，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果表明，RSD均小于3.0%，供試品溶液在室溫10h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4.3 重復(fù)性考察 精密稱取山東菏澤掌葉半夏藥材6份，按供試品溶液制備樣品，分別量取10μL注入液相色譜儀，以上述各共有指紋峰為檢測(cè)指標(biāo)，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積，結(jié)果顯示，RSD均小于3.0%，重復(fù)性良好。

3.4.4 不同產(chǎn)地掌葉半夏化學(xué)成分的指紋圖譜測(cè)定 取7個(gè)不同產(chǎn)地掌葉半夏藥材粉末，按述供試品溶液制備方法制備樣品，分別量取10μL注入色譜儀，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果顯示：7個(gè)產(chǎn)地的13個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜3%，7個(gè)產(chǎn)地的共有峰的相對(duì)峰面積相差較大，證明不同產(chǎn)地掌葉半夏藥材質(zhì)量有一定差異。見表3、4、圖1。

表3 不同產(chǎn)地藥材相對(duì)保留時(shí)間的指紋圖譜測(cè)定結(jié)果

表4 不同產(chǎn)地藥材相對(duì)峰面積的指紋圖譜測(cè)定結(jié)果

3.4.5 掌葉半夏化學(xué)成分指紋圖譜的聚類分析研究 本文采用SPSS軟件對(duì)指紋譜圖進(jìn)行了系統(tǒng)聚類分析，得到聚類樹圖5－11。聚類樹圖顯示：產(chǎn)地A1、A5、A7聚為1類，A4、A3、A6聚為1類，A2聚為1類。見圖2。

4.1 掌葉半夏化學(xué)成分指紋圖譜方法的建立 本實(shí)驗(yàn)以腺苷為參照物，采用梯度洗脫的HPLC法，建立了掌葉半夏藥材的指紋圖譜的測(cè)定方法，確定了13個(gè)共有峰，經(jīng)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性等方法學(xué)考察，RSD%均小于3.0%，證明此方法可行。

4.2 掌葉半夏化學(xué)成分指紋圖譜的聚類分析 7個(gè)產(chǎn)地掌葉半夏指紋圖譜的聚類樹圖顯示，產(chǎn)地A1、A5、A7聚為1類，產(chǎn)地A4、A3、A6聚為1類，產(chǎn)地A2與其它6個(gè)產(chǎn)地距離較遠(yuǎn)，聚為1類，聚類分析結(jié)果與藥材的形態(tài)學(xué)鑒別基本一致，產(chǎn)地相鄰的藥材基本聚為一類。

4.3 小結(jié) 本實(shí)驗(yàn)以腺苷為參照物，采用梯度洗脫的HPLC法，建立了掌葉半夏化學(xué)成分指紋圖譜。根據(jù)7個(gè)不同產(chǎn)地掌葉半夏指紋圖譜的相對(duì)保留時(shí)間，確定了13個(gè)共有指紋峰和共有峰位置，并建立標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的共有模式。采用系統(tǒng)聚類分析方法，建立了掌葉半夏質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，對(duì)7個(gè)產(chǎn)地藥材進(jìn)行了定量分類，聚類分析結(jié)果與藥材的形態(tài)學(xué)鑒別基本一致。

實(shí)驗(yàn)證明，該方法穩(wěn)定易行，為評(píng)價(jià)和控制掌葉半夏藥材內(nèi)在質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］秦文娟，王瑞，溫月笙，等.掌葉半夏化學(xué)成分的研究（Ⅴ）［J］.中草藥，1995，26（1）：3.

［2］王瑞，溫月笙，楊嵐，等.掌葉半夏化學(xué)成分的研究［J］.中國中藥雜志，1997，22（7）：421－423.

［3］上海第一醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科醫(yī)院，基礎(chǔ)部化學(xué)教研組.掌葉半夏治療子宮頸癌的研究［J］.上海醫(yī)學(xué)，1978，1（1）：13－16.

R284.1

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1007－8517（2013）03－0034－02

2012.12.29）