肖作淼，余路虎，李志紅，李文華，李江環(huán)，陳先春，唐金鳳，肖九長(zhǎng)

(贛州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西贛州341000)

簡(jiǎn)易“PNH三項(xiàng)”檢查對(duì)貧血類型鑒別的應(yīng)用

肖作淼，余路虎，李志紅，李文華，李江環(huán)，陳先春，唐金鳳，肖九長(zhǎng)

(贛州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西贛州341000)

目的研究簡(jiǎn)化的酸溶血試驗(yàn)、蔗糖溶血試驗(yàn)和尿含鐵血黃素試驗(yàn)即PNH三項(xiàng)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,PNH)的檢出效果。方法對(duì)4例PNH、3例AA-PNH綜合征患者、106例其他貧血患者及20例正常對(duì)照者進(jìn)行簡(jiǎn)易PNH三項(xiàng)試驗(yàn)，并統(tǒng)計(jì)各項(xiàng)試驗(yàn)在疾病中的陽(yáng)性檢出率。結(jié)果4例PNH和3例AAPNH患者PNH三項(xiàng)試驗(yàn)均為陽(yáng)性，其他貧血患者中，酸溶血試驗(yàn)均為陰性，而蔗糖血和尿含鐵血黃素試驗(yàn)單項(xiàng)目有不同程度的檢出。結(jié)論簡(jiǎn)易PNH三項(xiàng)聯(lián)合檢查對(duì)PNH和AA-PNH有良好檢出率且特異性強(qiáng)，但操作過(guò)程比傳統(tǒng)方法更加簡(jiǎn)便易行，值得基層實(shí)驗(yàn)室推廣。

酸溶血試驗(yàn)；蔗糖水溶血試驗(yàn)；尿含鐵血黃素；陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥

陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,PNH)是一種后天獲得的造血干細(xì)胞基因突變的克隆性疾病，臨床主要表現(xiàn)有血管內(nèi)溶血、靜脈栓塞形成、骨髓造血功能衰竭等[1]。酸溶血試驗(yàn)(即Ham試驗(yàn))、蔗糖溶血試驗(yàn)和尿含鐵血黃素(即Rous試驗(yàn))三個(gè)檢驗(yàn)項(xiàng)目，簡(jiǎn)稱PNH三項(xiàng)，是針對(duì)陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)診斷的檢驗(yàn)項(xiàng)目。為觀察PNH三項(xiàng)檢查對(duì)不同貧血疾病的鑒別診斷意義，我們對(duì)PNH、再生障礙性貧血(AA)-PNH綜合征，缺鐵性貧血(IDA)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)缺乏癥、骨髓增生異常綜合征(MDS)、巨幼細(xì)胞性貧血(MA)等不同類型的貧血病人進(jìn)行PNH三項(xiàng)檢查，同時(shí)對(duì)標(biāo)本采集、試劑貯備和實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行簡(jiǎn)化，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象為2010年3月至2012年9月113例贛州市人民醫(yī)院門診及住院的貧血和多系減少患者。男性48例，女性65例，中位年齡48.9(12～78)歲。觀察組各種疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合張之南的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[2]，其中經(jīng)CD55、CD59和FLAER檢查的PNH患者4例，確診AA 5～25個(gè)月的AA-PNH綜合征3例，經(jīng)鐵染色及血清鐵蛋白檢查的IDA患者20例、經(jīng)骨髓形態(tài)及血清葉酸和VitB12檢查的MA患者12例，經(jīng)骨髓形態(tài)和病理活檢檢查的MDS11例、經(jīng)Hb電泳或地中?；驒z查的地中海貧血患者2例、經(jīng)G6PD酶檢查的G6PD酶缺乏癥14例、經(jīng)Coombs試驗(yàn)檢查的AIHA18例。其他病例10例，包括脾亢4例、慢性病貧血3例及不明原因溶貧、骨髓纖維化、骨轉(zhuǎn)移癌各1例，以及經(jīng)血尿常規(guī)及肝腎功能檢查均正常的非血液科患者的正常人對(duì)照20例，男女各10例。

1.2 試劑

1.2.1 0.2mmol/L鹽酸溶液4℃保存。

1.2.2 92.4g/L蔗糖溶液分裝(4.5ml/人份)，-20℃保存[3]。

1.2.3 Rous試驗(yàn)試劑2g亞鐵氰化鉀加100ml蒸餾水溶解后，加入3ml濃鹽酸并加蒸餾水至200ml，充分混勻后立即分裝(4ml/人份)，-20℃保存[4]。

1.2.4 0.9%生理鹽水室溫保存。

1.3 儀器普通離心機(jī)和37℃水浴箱。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)本采集靜脈血取患者靜脈血6ml，其中EDTA抗凝管1ml、3.8%枸櫞酸鈉抗凝至2ml、余血加至普通管分離血清用。同時(shí)送檢30ml新鮮尿液。

1.4.2 酸溶血試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。操作步驟取EDTA血0.5ml用生理鹽水洗滌3次后配成配50%RBC懸液，然后按表1進(jìn)行。加塞置37℃水浴1h后，1000r/min離心2min觀察結(jié)果。結(jié)果判斷陰性：A管與B管均不溶血或標(biāo)本本身溶血者則兩

管溶血程度一致；陽(yáng)性：A管不溶血而B管溶血，或標(biāo)本本身溶血者則B管比A管溶血程度更嚴(yán)重。

表1 Ham試驗(yàn)操作步驟(單位：ml)

1.4.3 蔗糖溶血試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。首先將蔗糖溶液置37℃水浴箱中10min，然后按表2進(jìn)行。加塞后輕輕顛倒混勻，A管37℃水浴0.5h后，1000r/ min離心2min觀察結(jié)果。結(jié)果判斷陰性：A管上清液無(wú)溶血現(xiàn)象；陽(yáng)性：A管上清液有溶血現(xiàn)象而B管無(wú)或標(biāo)本本身溶血者則A管比B管上清液溶血程度更嚴(yán)重。

表2 蔗糖溶血試驗(yàn)操作步驟(單位：ml)

1.4.4 尿Rous試驗(yàn)將試劑置37℃水浴箱中5min，操作步驟及結(jié)果判斷參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。

2 結(jié)果

113例貧血患者中Ham陽(yáng)性者7例(6.2%),蔗糖溶血試驗(yàn)陽(yáng)性者11例(9.7%),Rous試驗(yàn)陽(yáng)性者22例(19.5%)。PNH三項(xiàng)全部陽(yáng)性者見(jiàn)于PNH和AA-PNH患者,對(duì)照組三項(xiàng)均為陰性。蔗糖溶血試驗(yàn)陽(yáng)性者在MDS、G6PD、AIHA和其他組溶血患者有檢出；尿Rous在MDS、G6PD和AIHA缺乏癥等亦有不同程度的檢出率。詳見(jiàn)表3。

3 討論

Ham試驗(yàn)對(duì)PNH的診斷特異性強(qiáng),敏感性為60%-86%,是臨床上確證PNH的主要依據(jù)[6],但僅憑這一項(xiàng)試驗(yàn)確診PNH是不夠的，因?yàn)榧s有10%的PNH患者Ham試驗(yàn)始終陰性[7]?！度珖?guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》中的Ham試驗(yàn)(6管法)操作強(qiáng)度大[8],存在以下幾方面不足：(1)標(biāo)本采集難：制備脫纖維血標(biāo)本容易引起標(biāo)本凝固或溶血。(2)找正常對(duì)照者難：要求與患者同血型或AB型正常對(duì)照者，導(dǎo)致試驗(yàn)難于進(jìn)行。(3)實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，故在現(xiàn)今日常工作任務(wù)繁重的檢驗(yàn)科嚴(yán)重受限。直接用EDTA抗凝血替代脫纖維血，用自身血清替代正常人血清，可大大簡(jiǎn)化標(biāo)本采集過(guò)程并明顯提高實(shí)驗(yàn)成功率。在113病例中有7例Ham試驗(yàn)陽(yáng)性者(其中1例PNH為弱陽(yáng)性)，顯示了應(yīng)用自身血清的2管法Ham試驗(yàn)對(duì)PNH及AA-PNH診斷有同樣的特異性，但操作步驟比6管法大大簡(jiǎn)化，易在日常工作中進(jìn)行。11例蔗糖溶血試驗(yàn)陽(yáng)性者中除PNH和AA-PNH外，在G6PD缺乏癥、MDS和AIHA病例中均有檢出，但陽(yáng)性率均在10%以內(nèi)。Rous試驗(yàn)的陽(yáng)性率檢出率最高，為19.5%(22/113)。由此得出糖水溶血試驗(yàn)和Rous試驗(yàn)在貧血病人中敏感性更高而特異性不如Ham試驗(yàn)。

表3 PNH三項(xiàng)檢查結(jié)果

PNH發(fā)病率不高，但因臨床表現(xiàn)多樣化，可單獨(dú)表現(xiàn)為貧血(1系減少)或多系減少，故臨床上PNH與AA、MDS及AIHA等疾病需彼此進(jìn)行鑒別診斷。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道11.1%~28.6%的AA患者可演變?yōu)镻NH[9]，故有必要對(duì)AA患者進(jìn)行定期PNH篩查。本組PNH患者分別有1月至7年的不明貧血原因的病史，亦側(cè)面反映臨床中PNH病人易誤診與漏診。目前，隨著流式細(xì)胞儀應(yīng)用，檢測(cè)糖基磷脂酰肌醇(GPI)缺陷細(xì)胞已成為診斷PNH最特異、最敏感且可以定量的最佳方法[1，9]，但昂貴的檢測(cè)費(fèi)用使流式檢查難以廣泛應(yīng)用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)GPI缺陷細(xì)胞不僅見(jiàn)于PNH病人，許多貧血性疾病都有不同程度的檢出[9],故有必要結(jié)合傳統(tǒng)檢查項(xiàng)目來(lái)相互印證。Ham試驗(yàn)、蔗糖水溶血試驗(yàn)及Rous

試驗(yàn)三項(xiàng)中連續(xù)兩次陽(yáng)性，排除AIHA即可確診PNH[10]，因此傳統(tǒng)項(xiàng)目在臨床上仍有重要的地位。但傳統(tǒng)方法步驟繁瑣，加上病例不多，目前在二級(jí)以下醫(yī)院開(kāi)展亦不普及，筆者在前人的工作基礎(chǔ)上，結(jié)合自身的工作經(jīng)驗(yàn)，從標(biāo)本采集到試劑準(zhǔn)備(將Rous試驗(yàn)和蔗糖溶血試劑配制后-20℃保存，使用前解凍，至少穩(wěn)定6個(gè)月)進(jìn)行簡(jiǎn)化，使PNH三項(xiàng)操作更加簡(jiǎn)便實(shí)用，三項(xiàng)聯(lián)合可大大提高PNH的檢出率，減少漏診與誤診，加上費(fèi)用低廉，臨床上樂(lè)意接受，故值得基層實(shí)驗(yàn)室推廣。

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R556.6+4

A

1674-1129(2013)01-0069-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.01.025