肖莉，后平欽，李國(guó)良

(江西省血液中心,江西南昌330077)

PCR-SSP法在ABO疑難血型鑒定中的應(yīng)用

肖莉，后平欽，李國(guó)良

(江西省血液中心,江西南昌330077)

目的采用PCR-SSP法檢測(cè)ABO基因型。方法ABO血型血清學(xué)正反定型不符樣本10個(gè)，用PCR-SSP法檢測(cè)其基因型。結(jié)果10個(gè)疑難血型標(biāo)本PCR-SSP法均得出明確的ABO血型結(jié)果。結(jié)論P(yáng)CR-SSP法檢測(cè)ABO血型方法可靠，可應(yīng)用于臨床輸血。

ABO血型；ABO血型基因型；PCR-SSP

1900年由Landsteiner發(fā)現(xiàn)的ABO血型系統(tǒng)在臨床輸血中具有極其重要的意義。ABO血型的標(biāo)準(zhǔn)血清學(xué)正反定型方法，因具有簡(jiǎn)單實(shí)用的特點(diǎn)而得到推廣和普及，但血清學(xué)試驗(yàn)亦存在局限性，受生理、病理等諸多因素的影響可導(dǎo)致正反定型不符。而基因分型方法在某些程度上克服了血清學(xué)試驗(yàn)的弱點(diǎn)，可以作為血清學(xué)方法的有益補(bǔ)充，為臨床輸血以及法醫(yī)中親子鑒定、個(gè)體識(shí)別提供強(qiáng)有力的檢測(cè)手段[1]。本實(shí)驗(yàn)采用PCR-SSP法對(duì)ABO正反定型不符的標(biāo)本作基因分型，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象本實(shí)驗(yàn)室和各大醫(yī)院送檢的血清學(xué)ABO正反定型不符，血型存在疑問(wèn)的血樣共10例。

1.2 血清學(xué)檢測(cè)試劑與方法抗A、抗B標(biāo)準(zhǔn)血清、ABO試劑紅細(xì)胞、篩選紅細(xì)胞、譜細(xì)胞購(gòu)自上海市血液中心。ABO血型鑒定采用試管法鹽水正反定型，抗體篩選和抗體鑒定采用間接抗人球法。

1.3 標(biāo)本的基本情況10個(gè)樣本全是先正反定型不符，放至4℃以及放散試驗(yàn)均未得出結(jié)果。1號(hào)為高效價(jià)的冷集素和溫抗體，3、4、9號(hào)為健康無(wú)償獻(xiàn)血者，5號(hào)為淋巴瘤患者，10號(hào)為血液病患者，6號(hào)為抗原減弱，2、7、8號(hào)為醫(yī)院送來(lái)的正反定型不符標(biāo)本。ABO血型檢測(cè)血清學(xué)反應(yīng)格局見(jiàn)表1。

1.4 DNA提取采用鹽酸胍為基礎(chǔ)的提取方法。鹽酸胍溶液使細(xì)胞裂解，蛋白質(zhì)變性，促進(jìn)DNA與硅膠模結(jié)合，經(jīng)過(guò)清洗和洗脫得到DNA。(由TBG公司提供)

表1 10例標(biāo)本的血清學(xué)反應(yīng)格局

1.5 擴(kuò)增引物ABO血型基因引物由天津秀鵬生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司提供。見(jiàn)表2。

表2 ABO基因引物PCR產(chǎn)物片段

1.6 總反應(yīng)體系10μl 0.1μlTAq酶(5U/μl)，0.9μlDNA(30ng/μl)，9μldNTP-Buffer工作液。

1.7 PCR擴(kuò)增使用美國(guó)PE9700型PCR擴(kuò)增儀，擴(kuò)增條件，96℃2min；96℃20s,68℃60s5個(gè)循環(huán)；96℃20s,65℃45s,72℃30s10個(gè)循環(huán)；96℃20s,62℃45s,72℃30s15個(gè)循環(huán)；72℃3min；4℃保存。

1.8 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)將每個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物(5～10μl)轉(zhuǎn)移到2.5%的瓊脂榶凝膠孔中，140～150V電泳15～20min，觀察結(jié)果，根據(jù)是否產(chǎn)生特異性條帶，并與結(jié)果分型表相比對(duì)，從而檢出血型。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 ABO基因擴(kuò)增片段電泳圖譜

2.2 樣品基因型與血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較見(jiàn)表3。

表3 ABO基因檢測(cè)結(jié)果與血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果相比較

3 討論

ABO血型系統(tǒng)有A、B、O三個(gè)基因，基因組DNA長(zhǎng)度約30Kb，位于9q34.1-9q34.2其核苷酸序列高度保守，ABO基因之間具有幾個(gè)堿基替換或單個(gè)堿基缺失，他們具有高度的同源性。B基因在cDNA上的297、526、657、703、796、803、930位有7個(gè)核苷酸與A基因不同[2]，使其編碼的B轉(zhuǎn)移酶的特異性不同于A轉(zhuǎn)移酶。O基因只是cDNA的第261位核苷酸不同，第261位胞嘧啶在O基因中的缺失，造成了O基因在261位后發(fā)生閱讀框架的移動(dòng)，形成了新的終止密碼子，提前終止了轉(zhuǎn)移酶的翻譯，使其編碼出的蛋白只有115個(gè)氨基酸，并且沒(méi)有轉(zhuǎn)移酶的催化功能[3]。

血清學(xué)方法鑒定ABO血型是通過(guò)檢測(cè)血型抗原和抗體來(lái)去確定，疑難者再附加吸收放散試驗(yàn)、唾液定型等項(xiàng)目，而抗原、抗體在不同亞型或某些疾病會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)弱變化影響血型的判斷[4],這時(shí)結(jié)果判讀的主觀性較大，不同實(shí)驗(yàn)室甚至不同實(shí)驗(yàn)人員之間的結(jié)果可比性不強(qiáng)，試劑的質(zhì)量對(duì)于鑒定結(jié)果有決定性影響等[5,6]。DNA不受上述因素的影響，ABO基因座位由7個(gè)外顯子組成，決定A、B轉(zhuǎn)移酶特異性的是第4、7外顯子編碼的氨基酸序列，迄今，已發(fā)現(xiàn)有30多種ABO亞型基因序列[7]，這些具有序列多態(tài)性的等位基因構(gòu)成了ABO血型分子生物學(xué)分型的基礎(chǔ)[8]。PCR-SSP技術(shù)檢測(cè)ABO血型基因型是利用ABO基因發(fā)生突變位點(diǎn)的不同核苷酸，分別設(shè)計(jì)一系列序列特異性引物，直接擴(kuò)增ABO血型基因DNA片段從而測(cè)得ABO血型及其亞型[9]。PCR-SSP法與血清學(xué)方法相比，克服了血清學(xué)鑒定只能鑒定表現(xiàn)型的局限，標(biāo)本1、5、10號(hào)不受疾病的影響；其它標(biāo)本血清學(xué)的假凝集、弱凝集現(xiàn)象血型鑒定均得到快速解決?；颊呓?jīng)基因檢驗(yàn)確定血型，給予同型血輸注治療取得滿(mǎn)意效果。

總之，用PCR-SSP法檢測(cè)血型方法可靠，并可精確到亞型，避免了結(jié)果誤差，對(duì)指導(dǎo)臨床診斷處理提供了理論依據(jù)。

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R457.1+1

A

1674-1129(2013)05-0444-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.05.014

江西省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(編號(hào)20073179)

肖莉，女，1975年5月，畢業(yè)于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，學(xué)士學(xué)位，副主任技師，主要從事輸血醫(yī)學(xué)研究。

李國(guó)良，男，1968年6月生，碩士學(xué)位，主任醫(yī)師，主要從事輸血醫(yī)學(xué)研究