許燕艷，翟鳳鈺，王亞帝，岳 莉，漆起貴，王 芳

MDA－MB－231細(xì)胞是三陰乳腺癌 (TNBC)中的一種細(xì)胞系，因其發(fā)病年齡早、預(yù)后差、極易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，成為乳腺癌患者死亡的主要原因。由于內(nèi)分泌治療和針對(duì)原癌基因人類表皮生長因子受體2(human epidermalgrowth factor receptor－2，Her－2)的靶向治療對(duì)TNBC無效，至今對(duì)TNBC仍缺乏令人滿意的綜合治療方案，故在臨床上積極發(fā)掘?qū)NBC有效的治療方案是非常必要的。研究表明，TNBC對(duì)以紫杉類為主的聯(lián)合化療比較敏感，容易獲得臨床完全緩解率(cCR)和病理完全緩解率 (pCR)，獲得cCR、pCR的患者有很好的遠(yuǎn)期生存［1］。多西他賽是一種半合成的紫杉類藥物，對(duì)于乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和其他多數(shù)腫瘤都具有抗癌活性，是治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌最有效的單藥之一［2］，但多西他賽在臨床應(yīng)用中發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)常會(huì)伴隨一系列藥物毒副作用，如骨髓抑制等。有研究已證實(shí)，低毒藥物與化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用可通過減少化療藥物的使用劑量而減輕對(duì)人體的毒副作用，同時(shí)又不會(huì)影響藥物的抗腫瘤作用，甚至能夠增加化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性［3］。塞來昔布是一種環(huán)氧合酶 －2(COX－2)抑制劑，具有預(yù)防和抑制腫瘤的作用。本研究采用塞來昔布聯(lián)合多西他賽作用于人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞，觀察兩藥聯(lián)合在體外對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，并探討其可能存在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞來自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)液、碘化丙錠 (PI)購于Sigma公司;新生胎牛血清、胰蛋白酶購于北京博奧森生物工程有限公司;兔抗人bcl－2、bax、survivin單克隆抗體購于Santa Cruz公司;多西他賽購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司;塞來昔布購于輝瑞制藥股份有限公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購于北京華美公司;羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱 (SHELL LAB公司，美國)，倒置顯微鏡 (Olympus公司，日本)，凈化工作臺(tái)(江蘇吳縣市凈化技術(shù)研究所，江蘇)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞置于含10%胎牛血清 (滅活)的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃、5%二氧化碳 (CO2)飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，0.25%胰酶消化液消化傳代，2～3 d傳代1次，所有實(shí)驗(yàn)采用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2 MTT微量酶反應(yīng)比色法檢測細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長期MDA－MB－231細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，接種于96孔板中，每孔180 μl，于5%CO2飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁。將96孔板隨機(jī)分為塞來昔布組 (60 μmol/L)、多西他賽組 (2.0 μmol/L)、聯(lián)合用藥組 (60 μmol/L塞來昔布+2.0 μmol/L多西他賽)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入MTT(5 g/L)15 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h棄去培養(yǎng)液，每孔再加入二甲基亞砜 (DMSO)150 μl，用微量振蕩器振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在570 nm波長下檢測每孔的吸光度 (OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。用兩藥相互作用系數(shù) (CDI)來評(píng)價(jià)兩藥相互作用性質(zhì)，CDI＜1，表明兩藥作用性質(zhì)為協(xié)同;CDI=1，則兩藥作用性質(zhì)為相加;CDI＞1，則兩藥作用性質(zhì)為拮抗。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 瑞氏－吉姆薩染色 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，消化，計(jì)數(shù)，接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜。分別加入60 μmol/L塞來昔布、2.0 μmol/L多西他賽及 60 μmol/L塞來昔布 +2.0 μmol/L多西他賽，收集藥物處理48 h后的細(xì)胞，1 000 r/min，離心半徑為13.5 cm，4℃離心10 min，棄上清液，加入冷的磷酸鹽緩沖液 (PBS)，重復(fù)洗細(xì)胞2次。細(xì)胞涂片離心機(jī)甩片，瑞氏－吉姆薩染液染色，觀察細(xì)胞形態(tài)及顏色，并拍照。

1.2.4 Annexin－V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù) 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，消化，計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為1×105/ml，加入不同的藥物，收集藥物處理48 h后的細(xì)胞，于1 000 r/min離心5 min，離心半徑13.5 cm，用冷PBS清洗5 min后再于1 000 r/min離心5 min。加入FITC標(biāo)記的Annexin－V 195 μg/ml，室溫下避光孵育30 min，于 1 000 r/min離心 5 min，加入 190 μl Annexin－V－FITC結(jié)合液，PI(50 μg/ml)10 μl混勻，室溫靜止 5 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 蛋白印跡法 (Western Blot)檢測 bcl－2、bax、survivin的表達(dá) 將細(xì)胞裂解于RIPA裂解液中冰上裂解30 min，1 200 r/min離心5 min，離心半徑13.5 cm，取上清液，采用Folin－酚試劑法 (Lowry法)進(jìn)行蛋白定量，與緩沖液混合后煮沸5 min。取50 μg蛋白樣品在15%的SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳約3 h，然后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜上2 h。用5%脫脂奶粉封閉1 h后，按預(yù)染Marker標(biāo)記的分子量剪裁轉(zhuǎn)印膜，分別加入由雜交液稀釋的 bcl－2單抗(1∶1 000)、bax單抗 (1∶1 000)、survivin(1∶1 000)單抗，另選取正常乳腺組織作為對(duì)照組，4℃過夜。TTBS洗4次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗 (1∶800)作用30 min，接著在硝酸纖維塑膜中加入NBT/BCIP顯色液，避光顯色，X光片掃描成像，經(jīng)成像分析儀和圖像分析軟件對(duì)印記區(qū)帶進(jìn)行定量分析。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以 ()表示，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組MDA－MB－231細(xì)胞存活率比較 塞來昔布組、多西他賽組與聯(lián)合用藥組不同時(shí)間MDA－MB－231細(xì)胞存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F組間=9.78，P=0.03，F(xiàn)時(shí)間=10.45，P=0.03);其中塞來昔布組24 h與48 h、48 h與72 h、24 h與72 h比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q值分別為6.36、70.12和76.48，P＜0.0，5)。多西他賽組24 h與48 h、48 h與72 h、24 h與72 h比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q值分別為16.80、18.70和35.55，P＜0.05)。聯(lián)合用藥組24 h與48 h、48 h與72 h、24 h與72 h比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q值分別為6.19、26.41和45.56，P＜0.05)。24 h時(shí)塞來昔布組與聯(lián)合用藥組、多西他賽組與聯(lián)合用藥組、塞來昔布組與多西他塞組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q值分別為56.03、6.79和49.49，P＜0.05);48 h時(shí)塞來昔布組與聯(lián)合用藥組、多西他賽組與聯(lián)合用藥組、塞來昔布組與多西他賽組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q值分別為68.82、9.27和60.03，P＜0.05);72 h時(shí)塞來昔布組與聯(lián)合用藥組、多西他賽組與聯(lián)合用藥組、塞來昔布組與多西他賽組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q值分別為25.11、16.81和8.34，P＜0.05)。聯(lián)合用藥組作用于細(xì)胞24、48、72 h后CDI分別為:(0.46±0.21)、(0.23±0.14)、(0.17±0.04)。

圖1 不同藥物作用于MDA－MB－231細(xì)胞后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變Figure 1 Morphological analysis after different agents on MDA－MB－231

圖2 不同藥物作用于MDA－MB－231細(xì)胞48 h后細(xì)胞凋亡情況Figure 2 Cell apoptosis of MDA－MB－231 after action of different agents in different groups

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 瑞氏－吉姆薩染色，400倍光鏡下觀察到塞來昔布組與多西他賽組細(xì)胞出現(xiàn)雙核及停滯于分裂中期，聯(lián)合用藥組細(xì)胞表現(xiàn)為染色質(zhì)固縮、胞核碎裂及凋亡小體等典型的凋亡形態(tài) (見圖1)。

2.3 細(xì)胞凋亡情況 藥物作用于細(xì)胞48 h后，塞來昔布組細(xì)胞凋亡率為 (20.14±1.22)%、多西他賽組為 (54.60±1.37)%，聯(lián)合用藥組為 (59.85±1.42)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=1 395.96，P=0.00);其中塞來昔布組與聯(lián)合用藥組、多西他賽組與聯(lián)合用藥組、塞來昔布組與多西他賽組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q值分別為69.18、9.15和60.04，P＜0.05，見圖2)。

表1 三組不同時(shí)間MDA－MB－231細(xì)胞存活率比較 (，%)Table 1 Comparison of cell survival rate of MDA－MB－231 cells of three groups at different times

表1 三組不同時(shí)間MDA－MB－231細(xì)胞存活率比較 (，%)Table 1 Comparison of cell survival rate of MDA－MB－231 cells of three groups at different times

組別24 h 48 h 72 h塞來昔布組83.53±1.01 79.86±1.27 39.40±1.42多西他賽組 55.12±1.51 45.40±1.87 34.61±1.56聯(lián)合用藥組51.20±1.18 40.15±1.28 24.91±1.13

2.4 凋亡相關(guān)蛋白 bcl－2、bax、survivin的表達(dá) Western Blot結(jié)果顯示，塞來昔布組、多西他賽組和聯(lián)合用藥組作用于細(xì)胞48 h后，bcl－2表達(dá)分別下降至對(duì)照組的89.02%、75.63%、45.35%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=13.77，P＜0.05);bax表達(dá)上調(diào)至對(duì)照組的136.35%、157.24%、173.89%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=4.79，P＜0.05);survivin表達(dá)下降至對(duì)照組的80.42%、54.28%、35.85%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=10.28，P＜0.05，見圖3)。

圖3 Western－Blot檢測bax、bcl－2、survivin蛋白的表達(dá)Figure 3 Expressions of bax，bcl－2 and survivin detected by Western－Blot

3 討論

多西他賽屬于紫杉醇類藥物，其作用機(jī)制是促進(jìn)微管蛋白聚合，從而阻斷腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，抑制腫瘤細(xì)胞的復(fù)制，達(dá)到抗腫瘤的效果，目前臨床上多西他賽已廣泛用于乳腺癌［4］、肺癌［5］、胃癌［6］和食管癌等的治療。有研究表明，TNBC對(duì)以紫杉類為主的聯(lián)合化療較敏感，TNBC者比非TNBC者更易獲得cCR、pCR，獲得cCR、pCR的TNBC者與非TNBC者的5年無病生存期 (DFS)及總生存期 (OS)相似［7］。塞來昔布是美國searle pharmacia公司于1999年推向市場的非甾體抗炎藥，是COX－2選擇性抑制藥，可減輕傳統(tǒng)非甾體類抗炎藥對(duì)消化道系統(tǒng)的不良反應(yīng)，又有抗炎鎮(zhèn)痛的作用，臨床主要用于治療急慢性骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。目前國內(nèi)外流行病學(xué)及臨床研究表明，塞來昔布還具有預(yù)防和抑制腫瘤的作用，由于其靶向性強(qiáng)，毒副作用小，已在多種腫瘤預(yù)防和治療中發(fā)揮作用。許多研究證實(shí)，多西他賽能協(xié)同其他藥物作用于乳腺癌細(xì)胞［8］，但關(guān)于聯(lián)合塞來昔布對(duì)乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的研究報(bào)道較少，并且兩者抗腫瘤作用機(jī)制不同，無交叉耐藥，因此可考慮將兩者聯(lián)合應(yīng)用。

本研究結(jié)果顯示，塞來昔布組和多西他賽組均可抑制乳腺癌細(xì)胞生長，且聯(lián)合用藥組抑制作用強(qiáng)于兩單藥組，CDI均＜1，顯示兩藥有協(xié)同作用，這和Nakata等［9］在裸鼠人A431移植瘤模型實(shí)驗(yàn)中得出COX－2抑制劑能夠增強(qiáng)多西他賽的化療療效的結(jié)果一致。瑞氏－吉姆薩染色光鏡下觀察到聯(lián)合用藥組出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為染色質(zhì)固縮、胞核碎裂及凋亡小體等。流式細(xì)胞術(shù)還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率高于兩單藥組。有研究表明，紫杉醇類藥物可以誘導(dǎo)COX－2的轉(zhuǎn)錄，它的作用機(jī)制可能是紫杉醇類藥物激活了蛋白激酶C(PKC)和促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK)誘導(dǎo)COX－2表達(dá)并且使COX－2 mRNA穩(wěn)定性增強(qiáng)［10］，因此推測兩藥協(xié)同作用可能是塞來昔布拮抗了多西他賽對(duì)COX－2表達(dá)的誘導(dǎo)作用。

秦洪真等［11］研究得出雌激素受體陰性 (ER－)的腫瘤較雌激素受體陽性 (ER+)的腫瘤增殖能力強(qiáng)，因此可能對(duì)化療更為敏感，化療對(duì)于ER－的乳腺癌患者更有效。因此，塞來昔布聯(lián)合多西他賽對(duì)ER－的MDA－MB－231細(xì)胞的殺傷效果可能會(huì)比ER+的MCF－7細(xì)胞要好。即相同濃度的塞來昔布或多西他賽作用于MDA－MB－231細(xì)胞和MCF－7細(xì)胞相同時(shí)間后流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，MDA－MB－231細(xì)胞組的細(xì)胞凋亡率可能高于MCF－7細(xì)胞組。因此，對(duì)內(nèi)分泌治療和靶向治療都無效的TNBC患者來講，積極找尋低毒高效的化療藥物成為目前治療TNBC中亟待解決的問題。

凋亡即為程序性細(xì)胞死亡，是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境的重要因素之一，其分子機(jī)制可能是抑制 bcl－2及激活 bax的表達(dá)。bcl－2和bax都屬于bcl－2家族，bcl－2編碼蛋白抑制凋亡，bax編碼蛋白促進(jìn)凋亡，有文獻(xiàn)報(bào)道，bcl－2/bax比例可能是決定細(xì)胞對(duì)凋亡刺激信號(hào)的敏感性的重要因素之一［12］。bax可能誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，bcl－2與bax拮抗抑制細(xì)胞色素C釋放從而抑制細(xì)胞凋亡。有文獻(xiàn)報(bào)道，COX－2在MDA－MB－231等乳腺癌細(xì)胞中有較高表達(dá)，而在MCF－7等乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)［13］。有證據(jù)表明，COX－2基因表達(dá)增強(qiáng)可以導(dǎo)致bcl－2蛋白表達(dá)增加并引起細(xì)胞凋亡抑制［14］，這可能是MDA－MB－231細(xì)胞惡性程度較高的原因之一，也與本研究結(jié)果顯示COX－2抑制塞來昔布作用于細(xì)胞后bcl－2蛋白表達(dá)降低bax表達(dá)增強(qiáng)一致。survivin是凋亡抑制蛋白 (IAP)家族的成員之一。從此研究結(jié)果推測多西他賽通過下調(diào)抗凋亡因子bcl－2和survivin發(fā)揮抗腫瘤的作用。研究表明survivin基因?qū)е耣cl－2基因的轉(zhuǎn)錄激活［15］，并推測survivin基因與bcl－2基因可能有共同的激活機(jī)制，兩者協(xié)同發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)，而在乳腺癌中survivin蛋白的表達(dá)與bax蛋白的表達(dá)無關(guān)［16］。本研究采用Western－Blot法，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組較單藥組作用細(xì)胞48 h后，bcl－2及survivin的表達(dá)明顯下降而bax的表達(dá)明顯增加，推斷藥物可能通過抑制COX－2基因表達(dá)從而抑制bcl－2、survivin的表達(dá)，繼而上調(diào)bax蛋白的表達(dá)。

塞來昔布聯(lián)合多西他賽對(duì)人TNBC MDA－MB－231細(xì)胞具有影響其細(xì)胞周期分布、抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，從而為臨床上對(duì)TNBC患者的治療提供了參考。塞來昔布和多西他賽對(duì)MDA－MB－231細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡方面存在協(xié)同效應(yīng)，其機(jī)制可能是通過下調(diào)bcl－2、survivin及上調(diào)bax的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，而其協(xié)同機(jī)制可能是多方面的，還需要進(jìn)一步的研究。

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