馬良驍， 董在杰，，3， 蘇勝彥， 張建橋， 劉 偉， 李靈玲， 袁新華，

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無錫214081;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實驗室，江蘇 無錫214081;3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇 南京210095)

骨形成蛋白質(zhì)(Bone morphogenetic protein，BMP)是轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-beta，TGF-β)超家族的成員，是廣泛分布于動物骨組織的酸性蛋白質(zhì)，在修復(fù)骨質(zhì)缺損和促進(jìn)骨折愈合等方面發(fā)揮重要作用［1］，尤其在骨及牙齒的生長和損傷修復(fù)中發(fā)揮著重要作用［2-3］。目前，人們已從多種動物(如牛、豬、羊、兔、鼠、猴和人等)的骨基質(zhì)中分離出BMP［4］，其中BMP2 被認(rèn)為是活性最強(qiáng)的唯一能單獨(dú)誘導(dǎo)成骨的因子［2］，在骨修復(fù)過程中促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和基質(zhì)分泌，在體內(nèi)外均可誘導(dǎo)骨、軟骨形成，對骨折和骨缺損的治療發(fā)揮重要作用［5-6］。BMP2 在骨骼的生長和修復(fù)中是關(guān)鍵的中介物［7-8］，并且是骨骼的破碎復(fù)原所必須的［9］。BMP2 在骨骼形成的起始和調(diào)節(jié)中所起的主要作用是其遺傳變異與平常的骨質(zhì)疏松癥有關(guān)［10-11］。近來，BMP2 已經(jīng)在骨缺損的治療上得到應(yīng)用，如人類的骨質(zhì)疏松癥。異常的BMP2基因表達(dá)也與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)，且與骨質(zhì)疏松癥有著復(fù)雜的遺傳相關(guān)性［12-13］。自1988 年以來，由于BMP2 基因在BMP 家族占主導(dǎo)地位一直被廣泛地研究，特別是在骨誘導(dǎo)中起著重要作用，已經(jīng)成為骨骼和牙齒修復(fù)的治療作用劑［7］，也對脊柱融合有一定的作用［14］。BMP2B 基因作為BMP2 基因的一種類型具有BMP2 基因所具有的作用，對于魚類BMP2 基因的研究剛剛起步，而在鯉魚上卻未見報道。

本研究根據(jù)斑馬魚BMP2B 基因保守序列，設(shè)計并合成中間特異性引物，采用RT-PCR 和3'RACE技術(shù)克隆鯉魚BMP2B 基因，并對該序列進(jìn)行分析。同時運(yùn)用實時熒光定量PCR 技術(shù)對鯉魚8 個組織進(jìn)行組織表達(dá)譜分析，旨在了解建鯉BMP2B 基因的結(jié)構(gòu)、功能，從而為研究鯉魚肌間刺提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

建鯉取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院無錫淡水漁業(yè)研究中心宜興養(yǎng)殖基地，取建鯉腦、心臟、脾臟、肝臟、卵巢、鰓、腸和肌肉8 個組織，液氮速凍后放置于-80 ℃冰箱凍存，以便于總RNA 的提取。

1.2 總RNA 的提取及其反轉(zhuǎn)錄

建鯉總RNA 的提取按照TaKaRa 公司的RNAiso Plus 操作說明書進(jìn)行，提取完成后用DEPC水溶解。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的提取質(zhì)量，分光光度法檢測RNA 的濃度，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于后續(xù)的PCR反應(yīng)或-20 ℃保存，其余的RNA 于-80 ℃冰箱中保存。

1.3 建鯉BMP2B 基因片段的克隆

根據(jù)GenBank 中斑馬魚BMP2B 基因(NM_131360)保守區(qū)序列設(shè)計1 對引物BMP2B-F 和BMP2B-R(表1)，引物由Invitrogen 公司合成，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系:cDNA 模板2.0 μl，上下游引物(10 μmol/L)各2.0 μl，dNTP Mixture(10 mmol/L)5.0 μl，MgCl2(25 mmol/L)6.0 μl，10 ×PCR buffer 8.0 μl，rTaq 酶(5 U/μl)0.5 μl，加DEPC 水至總體積50.0 μl。PCR 反應(yīng)參數(shù):94 ℃5 min;94 ℃30 s，51 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個循環(huán);72℃7 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

根據(jù)中間片段序列擴(kuò)增結(jié)果設(shè)計3'RACE 引物GSP1 和GSP2，進(jìn)行3'RACE 的擴(kuò)增，其擴(kuò)增反應(yīng)體系條件程序按照TaKaRa 公司的RACE 試劑盒說明書進(jìn)行。試驗用到的引物及其相關(guān)信息見表1。

1.4 序列測定及其結(jié)果分析

采用PCR 產(chǎn)物直接測序法，將PCR 產(chǎn)物原液送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，序列同源性分析用BLAST program(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)。用DNAstar (Lasergene7.10)軟件進(jìn)行序列的拼接，確定正確的開放閱讀框，并推導(dǎo)其編碼的氨基酸序列。用ProP 1.0 Server 預(yù)測成對堿性氨基酸蛋白酶(Furin)裂解位點(diǎn);用NCBI Conserved Domains 查找工具分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域;用TMHMM進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測;用SignalP3.0 Server 在線進(jìn)行信號肽預(yù)測;用PredictProtein 軟件分析氨基酸功能性位點(diǎn);用NetPhos 2. 0 Server 預(yù)測磷酸化位點(diǎn);用PSIpred 程序預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu);用Clustal W 軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性分析;利用MEGA4.0 中的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 本研究使用的引物及其特征Table 1 Primers used in this study and their characteristics

1.5 建鯉BMP2B 基因在各組織中的表達(dá)分析

將建鯉3 尾魚的相同組織等量混合，提取總RNA，每個樣品設(shè)3 個重復(fù)。用Primer Express3.0軟件設(shè)計熒光定量PCR 引物，命名為B2B-F 和B2B-R。把腦、心臟、脾臟、肝臟、卵巢、鰓、腸和肌肉8 個組織的總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用于熒光定量PCR檢測，作組織表達(dá)分析。檢測中內(nèi)參基因用GAPDH，引物詳細(xì)信息見表1。

熒光定量PCR 檢測采用SYBR 定量檢測試劑盒(TaKaRa)，采用25.0 μl 的反應(yīng)體系，內(nèi)含Mix 12.5 μl、正反引物各0.5 μl、模板2.0 μl 及ddH2O 9.5 μl。反應(yīng)程序為95 ℃30 s;95 ℃5 s，60 ℃15 s，45 個循環(huán);隨后進(jìn)行熔解曲線檢測。

2 結(jié)果

2.1 建鯉BMP2B 基因片段克隆

根據(jù)BMP2B 基因測序結(jié)果通過DNAstar(Lasergene7.10)進(jìn)行序列拼接，得到片段長度為948 bp，3'非編碼區(qū)(UTR)為147 bp，開放閱讀框(Open reading frame，ORF)為801 bp，在3'非編碼區(qū)polyA前有2 個在細(xì)胞因子上常見的mRNA 不穩(wěn)定點(diǎn)(ATTTA)，1 個典型的多聚腺苷酸加尾信號(AATAAA)和1 個12 bp 的Poly(A)尾。

2.2 建鯉BMP2B 蛋白質(zhì)特征分析

經(jīng)推導(dǎo)，建鯉BMP2 B 基因片段ORF 共編碼266 個氨基酸(圖1)，分子組成為C1329H2077N411O399S8，相對分子量為30 453. 19，等電點(diǎn)理論值為7. 226。利用SMART(http://smart. embl-heidelberg. de/)軟件分析，發(fā)現(xiàn)在1 ～132位處有1個TGF-β前體肽區(qū)域，分別在99 ～116 位和145 ～163 位具有2 個低組成復(fù)雜性結(jié)構(gòu)域，在166 ～266 位處有1 個TGFβ 家族保守結(jié)構(gòu)域。用PredictProtein 軟件分析氨基酸功能位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)存在多個脊椎動物典型的修飾位點(diǎn)，在第208 位上含有1 個N-糖基化位點(diǎn)(N-X-S/T-X)，在第143 位上存在1個蛋白激酶C-磷酸化位點(diǎn)(S/T-X-R/K)，在第6 和60 位上共存在2 個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(S/T-X-X-D/E)，在第68 和135 位上共存在2 個N-豆蔻?；稽c(diǎn)(G-E/D/R/K/H/P/F/Y/W-X-X-S/T/A/G/C/N-P)，在 第184 位 存在1 個TGF-β家族標(biāo)簽(L/I/V/M-X-X-P-X-XF/Y-X-X-X-X-C-G-C)。用NetPhos 2. 0 Server預(yù)測發(fā)現(xiàn)有10 個磷酸化位點(diǎn)，分別是Ser42、Ser58、Ser78、Ser94、Ser97、Ser111、Ser120、Tyr172、Tyr190和Tyr247。包括20 種最常見的氨基酸，其中包含強(qiáng)堿性氨基酸(K 和R)32 個，強(qiáng)酸性氨基酸(D 和E)33 個，疏水性氨基酸(A、I、L、F、W 和V)85 個，極性氨基酸(N、C、Q、S、T和Y)73 個;含有7 個具有TGF-β 家族特征性的半胱氨酸殘基(Cys166、Cys195、Cys199、Cys230、Cys231、Cys263和Cys265)(表2)。

圖1 建鯉BMP2B 基因片段以及推導(dǎo)出的氨基酸序列Fig.1 BMP2B gene segment and deduced amino acid sequence of Cyprinus carpio var.Jian

表2 建鯉BMP2B 基因編碼的氨基酸組分Table 2 Composition of amino acids encoded by Cyprinus carpio var. Jian BMP2B gene

用SignalP 3. 0 server 預(yù)測信號肽，結(jié)果表明在N 端可能存在1 個由1 ～1 9 位氨基酸殘基組成的信號肽，分裂位點(diǎn)在1 9 ～2 0 位處;用在線預(yù)測工具TMHMM Server v. 2. 0 進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測，結(jié)果表明不存在跨膜區(qū);用PSIpred 程序預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)建鯉BMP2 B 基因二級結(jié)構(gòu)中，無規(guī)則卷曲(Coil)占比例最大(達(dá)60.90%)，β-折疊(Beta-strand)為30.45%，α-螺旋(Alpha-helix)最少(8.65%)(圖2)。

利用ProP 1.0 Server 預(yù)測發(fā)現(xiàn)在112 和148位有2 個Furin 裂解位點(diǎn)或前體肽裂解位點(diǎn)(RXKR，Arg(R)/Lys(K):2);通過NCBI 的CDD(conserved domain)工具分析發(fā)現(xiàn)，建鯉BMP2B基因氨基酸序列具有1 個TGFb 前導(dǎo)肽超家族和1 個TGFβ 超家族的保守結(jié)構(gòu)域(圖3)。

圖2 建鯉BMP2B 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.2 Predicted secondary structure of BMP2B protein of Cyprinus carpio var. Jian

圖3 建鯉BMP2B 基因結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.3 Predicted conserved domain of BMP2B gene of Cyprinus carpio var.Jian

2.3 建鯉BMP2B 基因編碼氨基酸同源性比較及其系統(tǒng)進(jìn)化樹

利用建鯉和其他25 個物種的BMP2 基因編碼的氨基酸序列，采用Clustal W 軟件作同源性分析。結(jié)果表明，與建鯉BMP2B 氨基酸序列的同源性(相似度)從高到低依次為斑馬魚(NP571435，90.6%)、墨西哥脂鯉(ABK34489，86.1%)、紅鰭東方鲀(AAO38819，77.4%)、大 西 洋 鮭(NP001167305，77.1%)、綠色斑點(diǎn)河豚(AAO33820，75.5%)、金頭鯛(AAS78628，75.3%)、牙鲆(BAD16743，75.3%)、青 鳉(NP001098378，72.8%)、人(ACV32591，69.6%)、野豬(CBA13441，69.6%)、白頰長臂猿(XP003252536，69.2%)、黑 猩 猩(XP514508，69.2%)、狨 猴(XP002747391，69.2%)、狝 猴(XP001115987，68.8%)、非 洲 爪 蟾(CAA45018，68.8%)、東彎翅蝙蝠(ACJ50547，68.7%)、野馬(XP001493945，68.4%)、家 山 羊(ACJ50550，68.3%)、原雞(NP989689，68.0%)、黃褐色果蝠(ACJ50543，67.9%)、非 洲 野 驢 (ACJ50552，67.9%)、 家 貓 (ACJ50548， 67.9%)、 牛(NP001092611， 67.9%)、 家 短 尾 負(fù) 鼠(XP001374502，67.6%)和馬鐵菊頭蝠(ACJ50544，67.5%)。同源性均達(dá)67.5% 以上，說明建鯉BMP2B 基因是非常保守的。

根據(jù)氨基酸序列比對情況，利用MEGA 4.0 軟件鄰接法(Neighbor Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果(圖4)表明，建鯉首先與同屬于鯉科的斑馬魚聚在一起，說明與斑馬魚的親緣關(guān)系最近，魚類聚在一起，而哺乳動物也明顯聚在一起，原雞和非洲爪蟾作為鳥類和兩棲類也單獨(dú)成為一枝，最后哺乳動物、鳥類、兩棲類和魚類共同聚在一起。得到的系統(tǒng)進(jìn)化樹反映了上述物種進(jìn)化關(guān)系的遠(yuǎn)近。。

圖4 基于建鯉和其他物種BMP2B 氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(用Bootstrap 法進(jìn)行1 000 次評估)Fig.4 Phylogenetic tree based on BMP2B amino acids of Cyprinus carpio var. Jian and other species (the parameter was evaluated 1 000 times by means of Bootstrap)

2.4 建鯉BMP2B 基因在各組織中的表達(dá)分析

以GAPDH 為內(nèi)參基因，用熒光定量PCR 方法檢測建鯉BMP2B 基因在腦、心臟、脾臟、肝臟、卵巢、鰓、腸、肌肉8 個組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，BMP2B 基因在8 個組織中均有表達(dá)，但表達(dá)水平不一樣。在肌肉中的表達(dá)豐度最高;在卵巢、肝臟中其次，呈中度表達(dá);再次是脾臟、鰓和腸，在心臟和腦中的表達(dá)量最低(圖5)。

圖5 基于熒光定量PCR 檢測的建鯉BMP2B 基因在各組織中的表達(dá)水平Fig.5 Expression level of C. carpio var. Jian BMP2B gene in different tissues detected by qRT-PCR

3 討論

對于魚類BMP2 基因研究剛剛起步，目前已經(jīng)得到斑馬魚BMP2A 和BMP2B 基因完整序列［15-16］，兩者之間的相似度達(dá)到88%，并且也跟小鼠、雞、非洲爪蟾表現(xiàn)出較高的同源性［17-18］。本研究通過RTPCR 和3'RACE 技術(shù)，首次克隆得到建鯉BMP2B 948 bp 的基因片段，經(jīng)過Clustal W 軟件進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，建鯉跟斑馬魚、墨西哥脂鯉的同源性較高，分別為90.6%和86.1%，高于金頭鯛與斑馬魚BMP2A 基因之間的同源性(60%)，也高于金頭鯛與斑馬魚BMP2B 基因之間的同源性(72%)［19］，更明顯高于與其他物種的同源性(67.5%～77.4%)，可能原因是建鯉與斑馬魚、墨西哥脂鯉同屬于鯉形目鯉科。建鯉與斑馬魚、墨西哥脂鯉的相似度略微低于金頭鯛與非洲爪蟾、原雞和牙鲆之間的相似度(87%～97%)［19］，這也說明不同物種間同源性是有種屬差異的。運(yùn)用MEGA 4.0 軟件鄰接法(Neighbor Joining，NJ)對建鯉與其他25 個物種進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明建鯉首先與斑馬魚聚在一起，說明與斑馬魚的親緣關(guān)系最近;再與墨西哥脂鯉聚在一起，跟同源性比對結(jié)果一致。金頭鯛屬于鱸形目鯛科，青鳉屬于鳉形目青鳉科，紅鰭東方鲀、綠色斑點(diǎn)河豚屬于鲀形目鲀科，牙鲆屬于鰈形目鲆科，大西洋鮭屬于鮭形目鮭科，與建鯉親緣關(guān)系較遠(yuǎn);而原雞屬于鳥類，非洲爪蟾屬于兩棲類，其他物種皆為哺乳類，金頭鯛等魚類皆為硬骨魚綱，因此與建鯉親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

斑馬魚BMP2A、BMP2B 基因序列和表達(dá)模式表現(xiàn)出跟高等脊椎動物高度的進(jìn)化保守性［18］，這跟BMP2 基因在脊椎動物組織生長初期高度保守的基因調(diào)控機(jī)制是一致的。經(jīng)過多重比對發(fā)現(xiàn)，建鯉BMP2B 基因具有一個標(biāo)志性的多氨基酸殘基保守區(qū)域，特別是在成熟肽內(nèi)部，也存在轉(zhuǎn)錄后修飾，比如N-糖基化，這種保守特征與BMP2 基因在脊椎動物中有著非常原始和重要的功能是一致的，特別是跟骨發(fā)生和骨形成等細(xì)胞分化復(fù)雜程度相關(guān)［19］。除此之外，建鯉BMP2B 基因同樣具有BMP 家族的典型特征:7 個保守的半胱氨酸殘基，1 個前肽與成熟肽之間共同的蛋白酶酶切位點(diǎn)(RXXR)，1 個TGF-β 家族的保守區(qū)域［7，20］。

肌間刺常見于低等真骨魚類，如鯉、鰣、刀鱭、鰳、鯽等肉中多細(xì)刺(即為肌間刺)，肌間刺有支持作用，但并不是像脊柱、肋骨那樣撐起軀體，保護(hù)內(nèi)臟，而主要是支撐大側(cè)肌肉，同時還涉及到肌肉力量的傳導(dǎo)［21］。鯉肌間刺成因可能來自于肌肉成纖維細(xì)胞、肌肉間充質(zhì)細(xì)胞、肌肉間葉細(xì)胞等的分化誘導(dǎo)。而BMP2 具有很強(qiáng)的成骨誘導(dǎo)活性，在骨缺損和骨折修復(fù)等方面都具有重要作用［22-24］，比如:BMP2 也可誘導(dǎo)未分化間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化［22］，試驗證實把BMP2 cDNA 通過腺病毒載體導(dǎo)入兔骨缺處形成新骨［23］，以此推斷建鯉BMP2B 基因很可能與其肌間刺有一定關(guān)系。

熒光定量PCR 檢測結(jié)果表明，建鯉BMP2B 基因在肌肉中的表達(dá)豐度最高，在卵巢、肝臟中其次，呈中度表達(dá)，再次是脾臟、鰓和腸，在心臟和腦中的表達(dá)量最低。這與非洲爪蟾BMP2 基因在卵巢中表達(dá)豐度最高［25］有所不同，非洲爪蟾BMP2 基因在心臟、肝臟、腦、脾臟、肺、睪丸中均有表達(dá)，但明顯低于卵巢［26］;在背部神經(jīng)管、心臟、耳、腎臟、咽弓等器官，斑馬魚BMP2A、BMP2B 基因與小鼠、非洲爪蟾BMP2 基因相同器官的表達(dá)是有差異的［27］，如非洲爪蟾BMP2 在心臟和嗅板表達(dá)［26］，斑馬魚BMP2A基因卻沒有表達(dá)。斑馬魚胚胎原腸胚時期在腹鰭沒有檢測到BMP2A 基因表達(dá)，BMP2B 基因卻有表達(dá)［16］;BMP2A 基因在胸鰭芽部表達(dá)，而BMP2B 基因卻不表達(dá);另外斑馬魚BMP2B 基因在心臟［28］、肝臟［29］中的表達(dá)豐度較高，這跟建鯉BMP2B 基因在相同器官組織中表達(dá)也是略有差異的;與金頭鯛BMP2 基因在鈣化組織(骨、魚鱗、尾鰭)中表達(dá)豐度也有所不同，金頭鯛BMP2 基因除骨組織中最高表達(dá)外，在軟組織(如肝臟)的表達(dá)豐度也較高［19］，這與建鯉BMP2B 基因大致相同，已有報道BMP2 基因表達(dá)模式在真骨魚類鰭發(fā)生有重要作用［30-31］;BMP2 基因在褐牙鲆成魚肝臟、腸和鰓中均有表達(dá)，但在鰓中表達(dá)豐度最高［32］，這與建鯉BMP2B 基因也有所不同。這也說明了同一基因在同一組織不同物種的表達(dá)豐度是有種屬差異性，也符合進(jìn)化規(guī)律。建鯉BMP2B 基因在肌肉中的表達(dá)豐度最高可能與肌間刺發(fā)生有關(guān)。

在真骨魚類里，隨著魚類由簡單向復(fù)雜的演化，肌間刺也發(fā)生了變化，其數(shù)量先增多，然后逐漸減少，直到進(jìn)化的某一階段而完全消失。如真骨魚類中較低等的海鰻(鰻形目)，它的肌間刺是所有魚類中最多的;到了比較高等的鯉魚、鰱魚(鯉形目)，肌間刺數(shù)量已經(jīng)有所下降;到了更高等的鯰魚(鲇形目)，已經(jīng)幾乎完全沒有肌間刺［33］。可以說，肌間刺的出現(xiàn)與消失，是真骨魚類演化過程中的某一特定階段的產(chǎn)物，其背后是基因變異和環(huán)境選擇的共同影響。也有研究發(fā)現(xiàn)，肌間刺的出現(xiàn)一定程度上增強(qiáng)了植食性魚類的力量［34］，使這些魚類能更好地適應(yīng)環(huán)境、逃避天敵，但這些也只是推測。

目前對于BMP2 基因的研究都是集中于其對于骨質(zhì)破碎及其修復(fù)等方面的作用，如臨床醫(yī)學(xué)上BMP2 基因已經(jīng)用于治療人類骨骼方面的病癥，如骨質(zhì)疏松癥、骨缺損、骨破碎等等，雖然鯉肌間刺很可能與BMP2B 基因有關(guān)，但肌間刺的發(fā)生機(jī)制機(jī)理尚未清楚，也沒有一個合理的機(jī)理模型，國內(nèi)外的研究尚在進(jìn)行之中，所以仍需進(jìn)行可能與肌間刺形成相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制和相關(guān)關(guān)系的研究與探索。

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