李文良， 毛 立， 張紋紋， 楊蕾蕾， 王小敏， 江杰元

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京210014)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一種豬的高度接觸性傳染病，是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的必須報告的疫病，對世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害。CSFV 屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，基因組為單股正鏈RNA，長約12.3 kb，編碼1 個由3 900個氨基酸組成的多聚蛋白［1］。在宿主和病毒蛋白酶作用下裂解成4 個結(jié)構(gòu)蛋白［C、E0(Erns)、E1、E2］和8 個非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)［1］。其中囊膜糖蛋白E2 介導(dǎo)病毒的感染，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，保護(hù)機(jī)體抵抗病毒的感染，是重要的保護(hù)性抗原之一［2-4］。因此，E2蛋白是研制新型活載體疫苗、亞單位疫苗的候選抗原［1，5-8］。E2 蛋白是糖基化蛋白，最近有研究結(jié)果表明，E2、E0 的糖基化對其免疫保護(hù)作用起決定作用，未糖基化的蛋白質(zhì)不具有免疫保護(hù)作用［9］。這為新型亞單位疫苗的研制提供了重要的理論依據(jù)。

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)水平高，表達(dá)產(chǎn)物可進(jìn)行翻譯后加工，其抗原性、免疫原性和功能等生物活性與天然蛋白相似等特點(diǎn)。國內(nèi)外許多學(xué)者采用該系統(tǒng)對E2 蛋白進(jìn)行了表達(dá)，目前國外已有商品化疫苗上市，如拜耳公司的BAYOVAC?CSF Marker 和英特威公司的Porcilis?Pesti，這兩種疫苗還有配合使用的ELISA 抗體鑒別檢測方法［1］。國內(nèi)許多單位都利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行E2 蛋白表達(dá)鑒定工作，但多為單獨(dú)表達(dá)E2 蛋白，沒有考慮引入信號肽和重組蛋白糖基化水平的檢測［7-8，10-11］，也很少有對其進(jìn)行糖基化水平的研究［12］。

本研究試圖利用Bac-to-Bac 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)豬瘟病毒糖基化E2 蛋白的重組桿狀病毒，并對目的蛋白的表達(dá)特性及其抗原性進(jìn)行鑒定，旨在為其免疫學(xué)特性和CSFV 新型亞單位疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Bac-to-Bac 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(包括轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pFastBacTMHT B、DH10Bac 細(xì)菌和Sf9 昆蟲細(xì)胞)由本實(shí)驗(yàn)室保存;限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶購自大連寶生物工程有限公司;Trizol 試劑購自Invitrogen 公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq 酶、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自杭州Axygen 公司;轉(zhuǎn)染試劑購自Promega 公司;HRP 標(biāo)記的兔抗豬IgG 和羊抗兔IgG 購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;DAB 顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;兔抗StrepⅡ標(biāo)簽多抗購自南京金斯瑞生物科技有限公司;PNGase F 購自New England BioLabs 公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)和ge2 基因的擴(kuò)增

參照文獻(xiàn)［9］并根據(jù)HCLV E2 基因序列設(shè)計(jì)RT-PCR 擴(kuò)增用引物，gE2F:5'-ATGGATCCATGGTCGTGCAAGGTGTGATATGGCTGTTACTGGTAACTGG GGCACAAGGCCGGCTAGCCTGCAA-3';gE2R:5'-GGA CTCGAGTCACTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCATTCTGCGAAGTAATC-3'，上下游引物分別引入糖基化信號肽序列和Strep Ⅱ標(biāo)簽序列(斜體部分)以及BamH I 和Xho I 位點(diǎn)(下劃線部分)，引物由南京思普金生物科技有限公司合成。

取200 μl 豬瘟兔化弱毒疫苗毒(南京天邦生物科技有限公司提供)，加入1 ml Trizol 試劑，振蕩混勻，靜置10 min，加入200 μl 氯仿，劇烈振蕩，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，小心吸取上清，加入等體積異丙醇混勻，－20 ℃放置2 h，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，棄上清，加入75%乙醇洗滌，干燥，加入10 μl 無Rnase 的雙蒸水溶解RNA。

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明用引物gE2R 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體為:2 ×ES reaction mix 10 μl，EasyScript RT/RI enzyme mix 1 μl，引物gE2R 1 μl，RNA 5 μl，無Rnase 的雙蒸水補(bǔ)足至20 μl。42 ℃反應(yīng)45 min，85 ℃加熱5 min 滅活反轉(zhuǎn)錄酶，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為:gE2F、gE2R(10 pmol/L)各1 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)2 μl，10 ×PCR buffer 2.5 μl，模板4 μl，Taq 酶(5 U /μl)0.5 μl，滅菌雙蒸水補(bǔ)至25 μl。循環(huán)參數(shù):94 ℃5 min;94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min，35 個循環(huán);72 ℃10 min。10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 產(chǎn)物。

1.3 重組載體質(zhì)粒pF-ge2 的構(gòu)建與鑒定

將回收的目的基因用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切，回收純化之后克隆入同樣酶切處理的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pFastBacTMHT B 中，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。對PCR 和BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒進(jìn)一步測序，將序列正確的陽性重組質(zhì)粒命名為pF-ge2。

1.4 重組質(zhì)粒rBac-ge2 的構(gòu)建

按照Bac-to-Bac 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)操作說明，將陽性質(zhì)粒pF-ge2 轉(zhuǎn)化含Bacmid 質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac，經(jīng)兩次藍(lán)白菌落篩選，挑取白色菌落培養(yǎng)，提取Bacmid 質(zhì)粒，利用gE2F 和M13R 進(jìn)行PCR 鑒定，獲得含ge2 基因的重組質(zhì)粒rBac-ge2。

1.5 重組桿狀病毒的獲得、PCR 鑒定與病毒擴(kuò)增

按照轉(zhuǎn)染試劑的操作說明將重組質(zhì)粒rBacge2 轉(zhuǎn)染Sf9 細(xì)胞，27 ℃靜置培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況。在轉(zhuǎn)染后第5 d 收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清，500 g 離心10 min 得到上清，獲得第1 代重組桿狀病毒，命名為rAc-gE2，置4 ℃避光保存。提取第1代桿狀病毒DNA，用引物gE2F 和gE2R PCR 擴(kuò)增目的基因，以鑒定外源基因是否整合進(jìn)重組桿狀病毒基因組。

將第1 代病毒繼續(xù)接種對數(shù)生長期的Sf9 細(xì)胞，27 ℃培養(yǎng)3 ～4 d 至細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時，即可收獲上清得到第2 代病毒，用同樣的方法獲得第3代病毒，每一代病毒均置4 ℃避光保存。

1.6 重組E2 蛋白在Sf9 細(xì)胞中的表達(dá)與Westernblot 鑒定

將第3 代重組桿狀病毒感染Sf9 細(xì)胞，同時設(shè)野生型桿狀病毒感染Sf9 細(xì)胞作為對照，72 h 后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入預(yù)冷的PBS(0.01 mol/L、pH 7.2)，反復(fù)凍融3 次，超聲裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心15min，吸取上清，加入2 ×Loading buffer 煮沸10 min。取20 μl 樣品進(jìn)行SDS-PAGE，Western-blot 鑒定采用StrepⅡ標(biāo)簽多抗和CSFV 陽性豬血清(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)進(jìn)行。SDS-PAGE 電泳結(jié)束后，采用半干轉(zhuǎn)印法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，50 g/L脫脂乳室溫封閉4 h，分別加入1∶ 1 000 稀釋的StrepⅡ標(biāo)簽多抗和1∶ 200 稀釋的CSFV 陽性豬血清，37 ℃孵育2 h，PBST 洗滌3 次，加入1∶ 2 000稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 和兔抗豬IgG，37 ℃孵育1 h，PBST 洗滌3 次，加入DAB 顯色液，觀察特異性蛋白條帶。

1.7 重組蛋白糖基化檢測

參照PNGase F 操作說明書，取重組蛋白18 μl，加入2 μl 10 ×變性緩沖液，100 ℃處理10 min，然后加入3 μl 10 ×反應(yīng)緩沖液、3 μl 10% NP-40 和4 μl糖苷酶PNGase F，37 ℃作用1 h。與野毒蛋白、未處理蛋白一起，以StrepⅡ標(biāo)簽多抗為一抗進(jìn)行Western blot，操作同方法1.6，觀察處理前后蛋白質(zhì)分子量的變化。

2 結(jié)果

2.1 基因擴(kuò)增與重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建

將PCR 擴(kuò)增的目的基因(圖1 A)克隆入pFast-BacTMHT B 中，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑單菌落提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR 鑒定。取PCR 陽性質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切，獲得一條約1 100 bp的片段(圖1 B)。測序結(jié)果證實(shí)ge2 基因正確克隆入pFastBacTMHT B，且序列與原有序列完全一致，符合原有閱讀框，將該重組質(zhì)粒命名為pF-ge2。

圖1 ge2 基因的RT-PCR 擴(kuò)增(A)和重組質(zhì)粒pF-ge2 的酶切鑒定(B)Fig.1 Amplification of ge2 gene (A)and identification of the recombinant plasmid pF-ge2(B)

2.2 重組質(zhì)粒rBac-ge2 的構(gòu)建與鑒定

將pF-ge2 轉(zhuǎn)化含Bacmid 質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞DH10 Bac，發(fā)生位點(diǎn)特異性的轉(zhuǎn)座，經(jīng)3 種抗生素(卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素)抗性篩選和藍(lán)白菌落篩選，挑白色菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用gE2F 和M13R 進(jìn)行PCR 鑒定，擴(kuò)增出大小約1 800 bp 的條帶(圖2)，而以Bacmid 為模板的對照中未擴(kuò)出條帶，證明成功獲得重組質(zhì)粒rBac-ge2。

2.3 重組病毒的獲得與重組蛋白的Western-blot 鑒定

用rBac-ge2 轉(zhuǎn)染第1 代Sf9 病毒細(xì)胞病變出現(xiàn)不明顯，第2 代接種后3 d 就可看到明顯的細(xì)胞病變:細(xì)胞變大、變圓、脫落。提取重組病毒rAc-gE2基因組DNA，采用PCR 方法用引物gE2F 和gE2R擴(kuò)增ge2 基因，在1 100 bp 左右可見明顯條帶。取感染后72 h 細(xì)胞裂解上清用StrepⅡ標(biāo)簽多抗和CSFV 陽性豬血清對重組蛋白進(jìn)行Western-blot 鑒定，結(jié)果如圖3 所示。兩種抗體均能與重組蛋白產(chǎn)生特異性結(jié)合，而野生型病毒感染的細(xì)胞無此染色反應(yīng)條帶。

圖2 rBac-ge2 的PCR 鑒定Fig.2 Identification of rBac-ge2 by PCR

圖3 重組病毒rAc-gE2 的Western-blot 鑒定Fig.3 Western-blot analysis of gE2 protein expressed in rAcgE2

2.4 重組蛋白糖基化水平的檢測

將重組蛋白用PNGase F 處理后與野毒蛋白、未處理蛋白一起進(jìn)行Western-blot。如圖4 所示，未處理蛋白分子量約50 000，處理后蛋白分子量減為40 000，符合E2 蛋白的預(yù)計(jì)分子量，表明成功獲得糖基化的E2 重組蛋白。

3 討論

圖4 重組蛋白糖基化水平的檢測Fig.4 Detection of glycosylation of gE2 protein

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前常用的真核表達(dá)系統(tǒng)之一，其表達(dá)外源蛋白具有產(chǎn)量高、抗原性好、操作簡便快速等優(yōu)點(diǎn)，已在多種疫病研究中得到廣泛應(yīng)用。此外，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有與動物細(xì)胞相似的轉(zhuǎn)錄翻譯及翻譯后加工等功能，包括糖基化、磷酸化、?；?、信號肽切除等，外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)可以進(jìn)行正確的折疊而基本保持原有的生物活性。因此，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)常用來表達(dá)具有特定結(jié)構(gòu)功能的糖蛋白。

E2 蛋白76 位氨基酸含有1 個O-糖基化位點(diǎn)，在116、121、185、229、260 和297 位氨基酸含6 個N-糖基化位點(diǎn)［9，13-14］。對于病毒的糖蛋白來說，糖基化會影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象和中和抗體的產(chǎn)生，去除這些糖基化位點(diǎn)對其抗原性影響可能有3 種結(jié)果:增強(qiáng)、降低或無關(guān)。研究結(jié)果表明E2 蛋白76、116、121、185、229 位氨基酸的突變會明顯降低重組E2蛋白誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的滴度［9］。因此，獲得正確糖基化的E2 蛋白對于CSFV 診斷方法的建立和新型疫苗的研制至關(guān)重要。本研究克隆了包含信號肽的E2 蛋白基因，采用StrepⅡ多抗和陽性豬血清進(jìn)行Western blot 檢測證明獲得了糖基化的重組E2 蛋白，且2 種抗體檢測均可見2 個明顯條帶，這可能是蛋白糖基化程度不同所致。而采用針對桿狀病毒表達(dá)載體N 端His 標(biāo)簽的單抗鑒定未見目的條帶，表明成熟的蛋白質(zhì)不包含信號肽和融合的載體蛋白部分。用PNGase F 處理重組蛋白，蛋白質(zhì)分子量減小到40 000，進(jìn)一步證明表達(dá)的重組E2 蛋白是糖基化蛋白。

E2 蛋白的羧基端含有約40 個氨基酸組成的跨膜區(qū)(Transmembrane region，TMR)，該區(qū)域中疏水性氨基酸的比例高達(dá)65%以上，尤其是第356 ～375位的氨基酸，疏水性極強(qiáng)，它的存在對重組蛋白的表達(dá)有影響，而該區(qū)域不含有關(guān)鍵的抗原表位。研究結(jié)果表明去掉跨膜區(qū)可明顯提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量和可溶性［15］。本研究在去除跨膜區(qū)的基礎(chǔ)上在蛋白質(zhì)末端引入8 個氨基酸的StrepⅡ標(biāo)簽序列，利于切除信號肽后的E2 糖蛋白的鑒定和純化，且可以作為亞單位疫苗的陽性標(biāo)記與非結(jié)構(gòu)蛋白的陰性標(biāo)記共同用于野毒感染抗體的檢測。

總之，本研究結(jié)果表明E2 蛋白在重組桿狀病毒中得到正確表達(dá)，且可以糖基化，具有良好的抗原性，可以與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，這為CSFV 基因工程亞單位疫苗的研制和診斷方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

［1］ DONG X N，CHEN Y H. Marker vaccine strategies and candidate CSFV marker vaccines［J］. Vaccine，2007，25(2):205-230.

［2］ WEILAND E，STARK R，HAAS B，et al. Pestivirus glycoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfidelinked heterodimer［J］. J Virol，1990，64(8):3563-3569.

［3］ WANG Z，NIE Y，WANG P，et al. Characterization of classical swine fever virus entry by using pseudotyped viruses:E1 and E2 are sufficient to mediate viral entry［J］. Virology，2004，330(1):332-341.

［4］ DONG X N，CHEN Y H. Candidate peptide-vaccines induced immunity against CSFV and identified sequential neutralizing determinants in antigenic domain A of glycoprotein E2［J］. Vaccine，2006，24(11):1906-1913.

［5］ SUN Y，LIU D F，WANG Y F，et al. Generation and efficacy evaluation of a recombinant adenovirus expressing the E2 protein of classical swine fever virus［J］. Res Vet Sci，2010，88(1):77-82.

［6］ LIN G J，DENG M C，CHEN Z W，et al.Yeast expressed classical swine fever E2 subunit vaccine candidate provides complete protection against lethal challenge infection and prevents horizontal virus transmission［J］. Vaccine，2012，30(13):2336-2341.

［7］ 查云峰，徐興然，肖 昌，等. 豬瘟病毒E2 基因在昆蟲細(xì)胞中的分泌表達(dá)及活性檢測［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2005，36(10):1100-1105.

［8］ 范學(xué)政，徐 璐，王 琴，等.豬瘟病毒E2 基因密碼子優(yōu)化后在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)［J］. 中國獸醫(yī)雜志，2011，43(5):560-568.

［9］ GAVRILOV B K，ROGERS K，F(xiàn)ERNANDEZ-SAINZ I J，et al.Effects of glycosylation on antigenicity and immunogenicity of classical swine fever virus envelope proteins［J］.Virology，2011，420(2):135-145.

［10］ 韓建強(qiáng)，信愛國. 豬瘟病毒Erns和E2 基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)研究［J］. 西南大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2011，33(2):23-27.

［11］ 周向陽，萬 婧，廖 迅，等. 豬瘟病毒石門株E2 蛋白在桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)［J］. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33(1):28-32.

［12］ 彭伍平，夏照和，侯 強(qiáng)，等. 豬瘟病毒石門強(qiáng)毒株和兔化弱毒疫苗株E2 蛋白糖基化位點(diǎn)差異分析［J］. 病毒學(xué)報，2007，24(5):389-393.

［13］ RISATTI G R，HOLINKA L G，F(xiàn)ERNANDEZ-SAINZ I J，et al.N-linked glycosylation status of classical swine fever virus strain Brescia E2 glycoprotein influences virulence in swine［J］. J Virol，2007，81:924-933.

［14］ VAN RIJN P A，MIEDEMA G K，WENSVOORT G，et al. Antigenic structure of envelope glycoprotein E1 of hog cholera virus［J］. J Virol，1994，68:3934-3942.

［15］ HULST M M，WESTRA D F，WENSVOORT G，et al. Glycoprotein E1 of hog cholera virus expressed in insect cells protects swine from hog cholera［J］. J Virol，1993，67:5435-5442.