石 茹， 王 芳，3， 王 艦，3

(1.青海大學(xué)，青海 西寧810016;2.教育部青藏高原生物技術(shù)重點實驗室，青海 西寧810016;3.青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所，青海 西寧810016)

馬鈴薯屬無性繁殖，種質(zhì)資源短期或中期保存通常采用在緩慢生長條件下離體保存方式，但對長期保存來說，超低溫技術(shù)則是一種比較理想的方法。液氮凍存時，幾乎所有細胞都停止代謝活動，而細胞活力和形態(tài)發(fā)生的潛能仍能保持，同時又可避免感染或污染等風(fēng)險。

玻璃化法是20 世紀90 年代前后發(fā)展起來的超低溫保存新方法［1］，節(jié)省空間、操作簡便、重演性好，可以避免繁瑣的繼代培養(yǎng)，同時又可避免保存時體細胞發(fā)生變異［2-4］。迄今，利用玻璃化法已成功保存了李［5］、番木瓜［6］、芋頭［7］、菠蘿［8］等多種植物的離體莖尖，已有多個國家建立了馬鈴薯超低溫基因庫［9］。然而，國內(nèi)馬鈴薯超低溫保存研究起步較晚，保存后的成活率較低。本研究以馬鈴薯離體莖尖為材料，在前人研究的基礎(chǔ)上，探尋適合馬鈴薯莖尖玻璃化法超低溫保存的最優(yōu)體系，提高成活率和再生率，為長期穩(wěn)定地保存馬鈴薯種質(zhì)資源提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青薯9 號、大西洋、小白花、E107 試管苗由青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。試管苗繼代培養(yǎng)在添加30 g/L蔗糖、6 g/L 瓊脂的MS 培養(yǎng)基(pH 5.8)上進行，培養(yǎng)溫度為(20 ±2)℃，光照16 h/d，光源采用冷白色熒光燈管，光照強度為3 000 lx，20 ～25 d 轉(zhuǎn)接1 次。

1.2 馬鈴薯離體莖尖玻璃化保存方法

以青薯9 號、大西洋、小白花為試驗材料，每處理10 個莖尖，3 次重復(fù)。

1.2.1 莖尖剝離 選取繼代培養(yǎng)30 ～40 d 的健康植株，在無菌條件下，利用雙目實體解剖鏡剝?nèi)∏o尖。莖尖的葉原基個數(shù)分別為0、1、2、3 個以上，莖尖大小分別設(shè)為0 ～1.0 mm、1.1 ～2.0 mm、2.1 ～3.0 mm、＞3.0 mm。為防止莖尖干燥，剝離后立即置于0.1 mol/L 蔗糖的MS 培養(yǎng)液中。

1.2.2 莖尖預(yù)培養(yǎng) 將剝離好的莖尖放在培養(yǎng)液(MS+0.04 mg/L KT+0.10 mol/L 蔗糖，pH 5.8，過濾滅菌)中進行預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)時間分別設(shè)0 h、2 h、4 h、6 h、24 h。

1.2.3 裝載 將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的莖尖在室溫下用裝載液(MS +2.0 mol/L 甘油+0.4 mol/L 蔗糖，pH 5.8，高溫滅菌)進行裝載處理。裝載時間分別設(shè)0 min、20 min、40 min、60 min、80 min。

1.2.4 脫水處理 裝載處理后，用經(jīng)過0 ℃預(yù)冷的PVS2(Plant vitrification solution 2)進行脫水處理，脫水時間分別設(shè)0 min、25 min、30 min、35 min、40 min、45 min、50 min、60 min。整個過程必須在0 ℃下進行。

1.2.5 液氮保存 莖尖經(jīng)過以上處理后，裝入1.8 ml 冷凍管中，加少許新鮮的PVS2溶液，注入液氮，蓋上蓋子，迅速投入液氮罐中保存，保存時間不少于24 h。

1.2.6 解凍處理和再培養(yǎng) 從液氮中取出保存材料，室溫下浸入恢復(fù)培養(yǎng)液(MS +1.2 mol/L 蔗糖，pH 5.8)中90 s 迅速解凍，然后吸出混合液體，加入恢復(fù)培養(yǎng)液，輕微混勻，在第5 min、15 min 時更換新的恢復(fù)培養(yǎng)液，第25 min 取出莖尖放置在濾紙上數(shù)秒，轉(zhuǎn)接在恢復(fù)培養(yǎng)基中，(17 ±1)℃下暗培養(yǎng)10 d后，轉(zhuǎn)入弱光條件下培養(yǎng)20 d，再轉(zhuǎn)入正常光照下培養(yǎng)。半個月后統(tǒng)計成活率(莖尖轉(zhuǎn)為綠色的材料占試驗材料總數(shù)的百分率);1 個月后統(tǒng)計再生率(葉原基展開即莖尖長芽的材料占試驗材料總數(shù)的百分率)，再生植株移入溫室內(nèi)栽培。

1.3 利用正交設(shè)計優(yōu)化超低溫保存體系

以青薯9 號為試驗材料，對4 個主要影響因素:莖尖大小、預(yù)培養(yǎng)時間、裝載時間、脫水時間進行正交設(shè)計，探討四者結(jié)合對玻璃化法超低溫保存馬鈴薯離體莖尖成活率的影響。按照正交表L9(34)設(shè)計各因素及水平(表1)，每處理10 個莖尖，3 次重復(fù)。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal test

1.4 遺傳穩(wěn)定性檢測

參照Ghislain 等［10］的方法對超低溫保存后再生植株的遺傳穩(wěn)定性進行SSR 檢測。參照邸宏等［11］的CTAB 方法，對4 個品種的試管苗和超低溫保存后的再生苗各10 株提取DNA。DNA 用ddH2O稀釋至50 ng/μl備用。

所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系為20.0 μl，包含10 ×PCR buffer 2.0 μl、dNTPs(10 mmol/L)0.8 μl、Taq 酶(2.5 U)0.3 μl、SSR 引物(10 μmol/L)各1 μl、模板DNA 1.0 μl、ddH2O 13.9 μl。PCR 反應(yīng)中所用Taq 酶、dNTP、PCR buffer 購自天根公司。SSR 擴增程序為:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃(不同引物有差別)退火45 s，72 ℃延伸90 s，35 個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 擴增產(chǎn)物采用12%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，恒定電壓120 V，電泳3 h。銀染法檢測并統(tǒng)計電泳結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)利用SAS 9.1 和Excel 軟件統(tǒng)計分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差測驗法進行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 正交試驗結(jié)果

由表2 可知，在9 組配比設(shè)計中，第9 個處理的成活率最高，達到60.28%;第6 個處理成活率最低，僅為26.12%。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，正交試驗的4 因素各水平間均存在極顯著差異，影響因素順序為PVS2 脫水時間＞裝載時間＞莖尖大?。绢A(yù)培養(yǎng)時間。T 值分析表明，獲得保存后最高成活率的最優(yōu)配比組合應(yīng)為A3B2C2D1，即2.1 ～3.0 mm 的馬鈴薯莖尖預(yù)培養(yǎng)4 h，室溫下裝載液裝載40 min，0 ℃PVS2脫水處理35 min。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

2.2 玻璃化法超低溫保存中單因子試驗分析

進行單因子試驗時，利用正交試驗結(jié)果，只變化單因子，其他處理按最佳組合進行。

2.2.1 莖尖大小 研究結(jié)果(圖1)表明，甘薯莖尖大小對超低溫保存后的成活率具有顯著影響。隨著莖尖從小到大，成活率先增加后減少，當(dāng)莖尖大小增加到2.1 ～3.0 mm 時，即帶有2 個葉原基時成活率最高，青薯9 號、大西洋、小白花分別為68.60%、57.50%、63.20%;大于3.0 mm 的莖尖(3 個以上葉原基)成活率明顯下降。

圖1 莖尖大小對甘薯成活率的影響Fig.1 Effects of tips sizes on the survival rates of potato

2.2.2 預(yù)培養(yǎng)時間 研究發(fā)現(xiàn)預(yù)培養(yǎng)時間對甘薯莖尖保存后的成活率影響顯著。預(yù)培養(yǎng)4 h 平均成活率最高，不進行預(yù)培養(yǎng)成活率均最低。預(yù)培養(yǎng)時間過長或過短都會導(dǎo)致成活率明顯下降。本試驗條件下，預(yù)培養(yǎng)的適宜時間為2 ～6 h，以4 h 為最佳(圖2)。

圖2 預(yù)培養(yǎng)時間對甘薯成活率的影響Fig.2 Effects of preculture time on the survival rates of potato

2.2.3 裝載液時間 結(jié)果顯示，大西洋莖尖預(yù)培養(yǎng)4 h 后未進行裝載處理，成活率最低(20.40%);隨裝載液處理時間延長成活率不斷提高，當(dāng)莖尖在裝載液中處理40 min 時，青薯9 號、大西洋、小白花保存后成活率均最高，分別為63.20%、58.20%、60.00%。但隨著時間繼續(xù)延長，成活率顯著下降，表明裝載時最佳處理時間為40 min(圖3)。

圖3 裝載液預(yù)處理對甘薯成活率的影響Fig.3 Effects of time duration for loading buffer on survival rates of potato

2.2.4 PVS2處理 將2.1 ～3.0 mm 的莖尖預(yù)培養(yǎng)4 h、裝載處理40 min 后脫水，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)PVS2處理的莖尖全部死亡，PVS2處理35 min 成活率最高，顯著高于其他處理時間。但隨處理時間的延長，成活率又迅速下降(圖4)。表明PVS2處理時間在30 min至40 min 之間比較合適，35 min 效果最佳。

圖4 PVS2 處理時間對甘薯成活率的影響Fig.4 Effects of time exposed to PVS2 on the survival rates of potato

2.3 玻璃化法超低溫保存后的形態(tài)發(fā)生和植株再生

將保存的材料從液氮中取出，迅速解凍并洗滌后，接種到恢復(fù)培養(yǎng)基(MS +30 g/L 蔗糖+0.05 g/L EDTA+0.50 mg/L IAA+0.04 mg/L KT+0.10 mg/L GA3)上(圖5A)。莖尖解凍后轉(zhuǎn)接在再生培養(yǎng)基中，先進行10 d 的暗培養(yǎng)，然后過度轉(zhuǎn)移至正常光照下，可顯著提高其存活率。半個月后一部分莖尖呈白色或褐變;一部分莖尖愈傷化，分生組織和葉原基無序生長，最后死亡;大部分莖尖則直接成芽(圖5B ～D)。再生芽可在生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根(圖5E、F)。馬鈴薯較易生根，將超低溫保存后的形成再生苗轉(zhuǎn)接于MS 培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，7 d 左右即有根長出，且植株健壯，再生植株在形態(tài)上與對照無異(圖5G、H)。待有7 ～8 條根時，將發(fā)育良好的植株經(jīng)煉苗后移栽到溫室，大西洋、青薯9 號、小白花成活率分別為86.67%、100.00%、93.33%。

2.4 液氮凍存時間對成活率的影響

將青薯9 號的離體莖尖處理后于液氮中分別凍存1 d、7 d、30 d、60 d，然后進行恢復(fù)培養(yǎng)。方差分析結(jié)果顯示液氮凍存時間對超低溫保存后再生植株的成活率無顯著影響(表3)。

2.5 再生植株遺傳穩(wěn)定性分析

用30 對引物組合對超低溫保存前后的馬鈴薯莖尖進行PCR 擴增，從中篩選出譜帶清晰并呈現(xiàn)多態(tài)性的有效引物共10 對。對這10 對引物PCR擴增的譜帶進行分析，結(jié)果顯示:10 對引物組合共擴增出314 條帶，不同引物的擴增條帶數(shù)從6 條至30 條不等，其中青薯9 號有270 條帶，大西洋有275 條帶，小白花有239 條帶，E107 有280 條帶。超低溫保存前后的馬鈴薯之間未見明顯差異條帶(圖6、圖7)，這表明甘薯莖尖超低溫保存沒有發(fā)生遺傳變異。

3 討論

玻璃化法超低溫保存是目前長期而穩(wěn)定地保存植物種質(zhì)資源較為理想的方法。從理論上來說，在液氮低溫下，植物材料不會發(fā)生遺傳性狀的改變，并且可以無限期保存［12-14］。本試驗中，馬鈴薯莖尖保存60 d 的成活率和再生率與保存24 h 無顯著差異。但有關(guān)馬鈴薯種質(zhì)資源的長期保存，目前還在進行深入的研究。

材料的選擇是影響超低溫保存效果的直接因素。莖尖具有旺盛的恢復(fù)生長的能力，但莖尖大小會影響脫水的難易程度，莖尖過大不利于脫水，導(dǎo)致玻璃化程度不夠而影響保存后的成活率;莖尖過小，容易脫水，但不易于再生，而且冷凍保護劑對材料的毒害也比較大。Niino 等也認為PVS2處理時間與莖尖大小有關(guān)系，一般為十幾分鐘到幾個小時［15］。本試驗結(jié)果表明，帶有2 個葉原基的莖尖成活率明顯升高，過大過小都會使成活率顯著下降。此外，由于基因型不同，不同資源帶有2 個葉原基的莖尖大小也有差異，稍做調(diào)整即可。

圖5 青薯9 號莖尖超低溫保存后的植株再生過程Fig.5 The plantlet regeneration process of Qingshu 9 after cryopreservation

表3 液氮凍存時間對甘薯莖尖成活率的影響Table 3 Effects of different preservation times in liquid nitrogen on survival rates of potato shoot tips

超低溫保存前進行預(yù)培養(yǎng)和裝載處理，目的是增強細胞分裂與分化的同步化，促進脫水，增加含糖量，提高胞液的滲透勢，降低冰點，這樣能夠減少凍存過程中水分結(jié)冰對細胞膜的傷害，提高保存后的成活率［16-17］。但處理時間過短或過長都會對成活率有影響，過短則脫水不徹底;過長則蔗糖對細胞產(chǎn)生滲透脅迫，造成傷害，降低成活率。本研究預(yù)培養(yǎng)后成活率上升的原因可能是預(yù)培養(yǎng)液中加入了KT，有利于莖尖細胞分裂，從而使莖尖更易于成活［18］。

圖6 SSR 引物對E107、大西洋試管苗和超低溫保存后再生苗的擴增情況Fig.6 DNA fingerprint of E107 and Daxiyang regenerated plants detected by SSR primers STM2030，STM1053 and STM3023a before and after cyropreservation

圖7 SSR 引物對小白花、青薯9 號試管苗和超低溫保存后再生苗的擴增情況Fig.7 DNA fingerprints of Xiaobaihua and Qingshu 9 regenerated plants detected by SSR primers STM2030，STM1053 and STM3023a before and after cryopreservation

此外，恢復(fù)培養(yǎng)時光照條件以及時間長短也是影響存活率的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯莖尖解凍后再培養(yǎng)時，要使微小莖尖或頂端分生組織存活，則需要較長的恢復(fù)期，且對黑暗條件要求嚴格。暗培養(yǎng)3 d 或7 d 的莖尖見光后都會變成白色，很難存活，暗培養(yǎng)10 d 后緩慢過度到正常光照條件下，莖尖才能存活。這與桃［19］和藥用草本植物皖貝母［20］相似，也與王子成等超低溫保存脫除馬鈴薯病毒研究中的結(jié)果［21］一致。

本研究結(jié)果表明，馬鈴薯莖尖玻璃化法超低溫保存后的成活率可達60%以上，并且再生植株從形態(tài)和分子水平上都較好地保持了遺傳穩(wěn)定性，未出現(xiàn)遺傳變異，為馬鈴薯種質(zhì)資源的長期保存提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

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