羅 麗，梁 琪，張 炎，米 蘭

(甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070)

沙棗(Elaeagnus angustifolia L.)又名銀柳、七里香、桂香柳等，在我國主要分布在西北、華北、東北等地區(qū)，其果實富含糖類、蛋白質、脂類、黃酮和有機酸等，具有健胃、止瀉、利尿、排毒、去濕熱，降血壓、血糖、血脂等保健功能，是我國新疆和伊朗、土耳其民間治療惡心、嘔吐和胃脹的傳統(tǒng)藥方［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)，沙棗果實中富含黃酮類化合物(flavonoid)，黃酮類化合物又名生物類黃酮，屬植物次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于蔬菜、水果及谷物中，主要包括黃酮、黃烷酮和黃酮醇等，大部分是以糖甙形式存在，部分以甙元形式存在，具有抗氧化、防癌、抗炎、抗過敏，調節(jié)機體免疫、內分泌系統(tǒng)以及預防肥胖癥、糖尿病等作用，在食品、藥品、化妝品等方面有較大應用價值［4-6］。國內外對其他來源黃酮的提取及應用有很多研究報道，但沙棗果中黃酮的提取及應用卻鮮見報道。超聲波輔助有機溶劑提取能夠強化提取過程，提高有效成分的溶出速率、縮短提取時間、節(jié)約成本［7］;響應面法(Response surface method)則將多因素實驗中因素與指標的相互關系用多項式擬合，依此研究因素與響應面之間、因素與因素之間的相互關系，因此實驗次數(shù)少，且能夠滿足實驗對數(shù)據(jù)處理的要求，其結果可信度高，得到國內外科研學者的廣泛利用［8］。本實驗以沙棗果為原料，采用超聲波輔助丙醇提取法，在單因素實驗的基礎上，運用響應面法優(yōu)化沙棗果總黃酮的提取工藝，并分析各因素對沙棗果總黃酮提取率的影響，為沙棗果的進一步研究提供理論依據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棗果 采自甘肅酒泉;蘆丁標準品 Sigma公司;丙酮、石油醚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等 均為分析純。

JY96-ⅡN型超聲波細胞破碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;HWS26型數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;TDD5M低速離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司;721-3可見分光光度計 湖南益陽市儀表廠;電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 將沙棗果去除雜質、擦凈、曬干、去核，經(jīng)植物粉碎機粉碎，得到沙棗果肉粉，經(jīng)石油醚脫脂，揮干后備用。

1.2.2 沙棗果總黃酮的測定 標準曲線的繪制:參照文獻［9］，以蘆丁為對照品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色體系、分光光度法測定，并繪制標準曲線。蘆丁含量y(mg/m L)與溶液吸光度A之間建立回歸方程為:y=9.4235x+0.0248，R2=0.9989。

樣品提取率測定:準確吸取2m L濾液于10m L具塞試管中，加入0.3m L 5%NaNO2溶液，搖勻放置6m in后，加入0.3m L 10%Al(NO3)3溶液，6m in后加入10%NaOH溶液4m L，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，15m in后以試劑空白為參比，于510nm處測吸光度值A?？傸S酮提取率按公式1計算:

式中:C為經(jīng)吸光度值計算出的總黃酮濃度(mg/m L);V為測定時吸取的試液體積(m L);250為稀釋倍數(shù);m為樣品質量(g)。

1.2.3 沙棗果總黃酮提取及響應面設計

1.2.3.1 沙棗果總黃酮提取條件的初步確定［10-11］

采用單因素實驗考察提取劑、粒徑、提取次數(shù)、提取劑濃度、料液比、水浴時間、浸提溫度、超聲時間對沙棗果總黃酮提取率的影響。準確稱取1.000g干燥至恒重的沙棗果粉于50m L燒杯中，加入提取劑置于超聲波細胞破碎機提取，4000 r/m in離心10m in過濾，定容至50m L容量瓶，搖勻，靜置。吸取5m L提取液于25m L容量瓶進行稀釋，取2m L稀釋液按照1.2.2的方法進行測定。

1.2.3.2 全因子實驗設計［12］在單因素實驗的基礎上進行Plackett-burman實驗設計，對粒徑(A)、水浴時間(B)、提取劑濃度(C)、料液比(D)、浸提溫度(E)、超聲時間(F)6個因素，以提取液吸光度為響應值進行二級水平實驗，篩選出對提取率有顯著影響的因素，其水平編碼表見表1。

表1 實驗設計因素及其編碼水平Table1 Factors and levels in response surface design

1.2.3.3 最陡爬坡實驗［13］根據(jù)全因子實驗設計結果，利用多元一次方程回歸系數(shù)的符號和大小，設計顯著因素的最陡上升路徑，以實驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據(jù)各因素效應值的大小確定變化步長，有效逼近最大理想?yún)^(qū)域。

1.2.3.4 中心組合設計［14-15］以Plackett-Burman實驗篩選的三個顯著因素，結合最陡爬坡實驗結果確定的實驗水平進行響應面分析。利用統(tǒng)計軟件design-expert8.05對實驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取溶劑對總黃酮提取率的影響 由圖1可知，丙酮的提取效果最好，這是由于黃酮類化合物的極性較小，易溶于極性中等或中等偏下的溶劑。根據(jù)“相似相溶原理”，沙棗果總黃酮的極性與丙酮較接近，因此更容易浸出。

圖1 提取溶劑對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction yield of total flavonoids

2.1.2 粒徑對總黃酮提取率的影響 圖2表明，采用不同粒徑的沙棗果粉，總黃酮的提取率不同。粒徑越小(目數(shù)越大)，總黃酮提取率越高;但粒徑過小時，提取率反而降低。一方面，隨著粉體粒徑的減小，破碎所需的能量增大，物料因產(chǎn)生熱量而溫度升高;另一方面，當粉體粒徑過小時，離心沉降變得困難、費時，殘留的濾液過多，造成總黃酮成分的損失，所以顆粒徑不宜太小，以80目較適宜。

圖2 粒徑對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of crush treatment on extraction yield of total flavonoids

2.1.3 提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響 由表2可以看出，其他條件恒定，超聲處理后，提取2次時沙棗果總黃酮提取率為3.004%，第3次提取時，提取液的吸光度很小，與前兩次吸光度相比差異較大，總黃酮提取率增加不明顯，故選擇提取2次為宜。

表2 提取次數(shù)的確定Table2 Determination of extraction times on extraction yield of total flavonoid

2.1.4 料液比對總黃酮提取率的影響 由圖3可知，料液比在1∶10～1∶25(g/m L)之間時，隨液體比例的增加，總黃酮提取率逐漸增大，當料液比為1∶25(g/m L)時提取率達到最大3.256%，之后總黃酮提取率呈迅速下降趨勢。一般增加溶劑的量可以使細胞壁內外濃度差增大，有利于有效成分的溶出，當料液比小于1∶25(g/m L)后，由于傳質效率已趨于最大，總黃酮提取量達到飽和，再增大溶劑量，其吸光度值降低，因此確定料液比為1∶25(g/m L)。

圖3 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on extraction yield of total flavonoids

圖4 提取劑濃度對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of acetone concentration on extraction yield of total flavonoids

2.1.5 提取劑濃度對總黃酮提取率的影響 以1∶25 (g/m L)的料液比，考察不同丙酮濃度對總黃酮提取率的影響。由圖4可得，隨丙酮濃度的增大，總黃酮提取率也隨之增大;當濃度為70%時，總黃酮提取率達最大3.362%，但隨著濃度的進一步增大，總黃酮提取率反而降低。在超聲過程中，有機溶劑對細胞膜的破壞作用強于水，這是總黃酮提取率增大的一個原因;另一方面，由于黃酮是一大類物質，其極性和化學性質的不同導致部分水溶部分醇溶，且在不同濃度下的溶解度不同，當濃度繼續(xù)增大時，溶液極性相對偏高，從而導致黃酮溶解度降低。

2.1.6 水浴時間對總黃酮提取率的影響 由圖5可得，在其他條件恒定時，沙棗果總黃酮的提取率在水浴時間20～40min之間，隨時間延長呈現(xiàn)先增后降的趨勢，當水浴 30m in時，總黃酮提取率達最大3.223%。因此，處理30m in為最佳水浴浸提時間。

圖5 水浴時間對總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time of water bath on extraction yield of total flavonoids

2.1.7 浸提溫度對總黃酮提取率的影響 由圖6可知，總黃酮提取率受溫度影響較大，隨溫度的升高，提取率先增后降，45℃時達到最大3.342%。隨溫度升高，分子運動速度加快，有效成分滲透和溶解速度加快，從而可以提高黃酮類物質的溶出速率，但當溫度升高到一定程度時，黃酮類物質的結構發(fā)生變化，雜質溶出量增加，導致總黃酮提取率有所降低［16］。

圖6 浸提溫度對總黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on extraction yield of total flavonoids

2.1.8 超聲時間對總黃酮提取率的影響 由圖7可知，總黃酮提取率隨超聲處理時間延長呈先增后降趨勢。隨超聲時間延長，提取溶劑溫度不斷升高，使黃酮類物質分解，原料中其它成分溶出率提高，并且時間越長耗能越多，故最終選取25min為最佳提取時間。

2.2 響應面法優(yōu)化沙棗果黃酮超聲提取工藝

2.2.1 全因子實驗設計結果 根據(jù)單因素實驗結果，進行Plackett-burman實驗設計，考察粒徑(A)、水浴時間(B)、提取劑濃度(C)、料液比(D)、浸提溫度(E)、超聲時間(F)6個因素對沙棗果總黃酮提取率的影響，以提取液吸光度為響應值，實驗結果見表3。

根據(jù)表3實驗設計結果進行回歸模型方差分析，結果見表4，得到回歸方程為:Y=0.59+3.750× 10-4A+3.158×10-3B+7.558×10-3C+0.014D-0.026E+0.014F，其p=0.0216＜0.05，因此該模型的相關性良好。由表4分析結果可以看到，各因素中對總黃酮提取率影響顯著的因素為料液比、浸提溫度、超聲時間，可作為進一步優(yōu)化的條件。

圖7 超聲時間對總黃酮提取率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic treatment time on extraction yield of total flavonoids

表3 Plackett-burman實驗設計及響應值表Table3 Experimental design of Plackett-burman and response value table

表4 Plackett-burman實驗因素水平主效應分析Table4 Analysis ofmain effect on Plackett-burman test factor levels

2.2.2 最陡爬坡實驗 根據(jù)2.2.1得到的回歸方程和表4的分析結果來確定最陡爬坡方向。料液比(D)、浸提溫度(E)和超聲時間(F)對總黃酮提取率的影響最顯著，其中D和F系數(shù)為正，E系數(shù)為負，說明適當增大料液比和延長超聲時間、降低浸提溫度可以增加總黃酮提取率，以單因素實驗的中心點為最陡爬坡實驗的設計起點，結果見表5。

表5 總黃酮提取爬坡實驗及結果Table5 Design and results of the steepest ascent experiment of total flavonoids

2.2.3 中心組合設計及結果 以最陡爬坡實驗的最優(yōu)值為中心，進行二次旋轉中心組合設計，設計共20個實驗點，其中14個析因點，6個中心點，實驗設計及結果見表6。

表6 響應面分析方案及實驗結果Table6 Design scheme and results of responce surface analysis

通過Design-expert8.05軟件進行二次響應面回歸分析，得到回歸方程為:Y=3.80-0.022D-0.091E+0.12F+0.083DE-0.043EF-8.765×10-3EF-0.25D2-0.42E2-0.21F2。對該方程及各因素進行方差分析，回歸方程的有效性及各因素對提取率的影響程度結果見表7。

從表7方差分析結果可以看出，該模型極顯著(p=0.0004＜0.01)，且失擬項不顯著(p=0.1306＞0.05)，其決定系數(shù)R2=0.9100，說明回歸方程的擬合程度較好，其響應值的變化有91%與所選變量有關，該模型具有實際應用意義。

從回歸方程各項方差分析結果看出，D2、E2、F2對總黃酮提取率的影響極顯著，F(xiàn)對總黃酮提取率的影響顯著?？梢?實驗各因素對總黃酮提取率的影響不是簡單的線性關系，各因素對沙棗果總黃酮提取率影響大小順序為:超聲時間＞浸提溫度＞料液比。

表7 響應面回歸模型方差分析Table7 ANOVA of the constructed response surface regression model

2.2.4 響應曲面的擬合以及最佳操作點的確定 圖8～圖10是由多元二次回歸方程所做的各因素之間兩兩相互作用對沙棗果總黃酮提取率的影響響應面圖。由此可見，響應值(總黃酮提取率)隨料液比、浸提溫度和超聲時間增大呈先增后降的趨勢，說明三個因素在所選范圍內能產(chǎn)生最佳的響應值。由圖8可知，在超聲時間26m in、浸提溫度不變時，隨料液比增大，提取率先升高后緩慢降低;超聲時間26min、料液比不變時，隨浸提溫度升高，提取率先增大后迅速降低，說明料液比對響應值的影響比浸提溫度大。由圖9可知，在料液比1∶26(g/m L)、超聲時間不變時，隨浸提溫度升高，提取率先增大后降低;在料液比1∶26(g/m L)、浸提溫度不變時，隨超聲時間延長，提取率先增大后緩慢降低，說明超聲時間對響應值的影響較浸提溫度大。

圖8 料液比和浸提溫度對總黃酮提取率的影響Fig.8 Response surface plot for effects of liquid-solid ratio and extraction temperature on extraction yield of total flavonoids

通過中心組合設計對實驗進行結果優(yōu)化，得出最佳提取條件為:料液比1∶25.63(g/m L)，浸提溫度42.03℃，超聲時間27.19min，此條件下黃酮提取率預測值為3.827%。

圖9 浸提溫度和超聲時間對總黃酮提取率的影響Fig.9 Response surface plot for effects of extraction temperature and ultrasonic treatment time on extraction yield of total flavonoids

2.3 驗證實驗

為檢驗響應面法所得結果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進行沙棗果總黃酮提取?？紤]到實際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為料液比1∶25.5(g/m L)，浸提溫度42℃，超聲時間27min，在此提取工藝條件下，得樣品平均提取率為3.91%，比單因素實驗得出的最大值3.362%高出0.548%，與預測值相符度為98%，說明實驗結果與模型符合良好，因此，基于響應面法分析所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準確可靠，具有實際參考價值。

3 結論

以沙棗果為原料，通過單因素實驗，評價了提取溶劑、粒徑、提取次數(shù)、提取劑濃度、料液比、浸提時間、浸提溫度、超聲時間等對沙棗果總黃酮提取率的影響。用Design-expert 8.05進行P-B實驗設計、爬坡實驗和中心組合設計，得出超聲波輔助丙酮溶劑提取沙棗果總黃酮的最佳提取工藝條件為:料液比1∶25.5(g/m L)，浸提溫度42℃，超聲時間27m in，此條件下預測沙棗果總黃酮提取率為3.827%。實際測得的總黃酮提取率為3.91%，與模型的預測值基本相符，因此認為經(jīng)優(yōu)化后的提取條件合理可行。

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