朱 苗，袁清霞，程 杰，李 恒，李莉梅，張桂和，曾富華，*

（1.海南大學食品學院，海南?？?70228；2.湛江師范學院生命科學與技術學院，廣東湛江524048；3.廣東高校邊緣熱帶特色植物工程技術開發(fā)中心，廣東湛江524048）

我國仙人掌主要分布在廣西、廣東、江西、福建等省，資源豐富，發(fā)展?jié)摿薮螅_發(fā)和利用野生仙人掌符合當今人們自然、健康、綠色的消費需求，在國內外市場都有廣闊的發(fā)展空間。20世紀早期常被用作牲畜飼料和造酒的原料，在民間也很早就作為治療潰瘍、抗炎、蛇咬傷等的藥物[1]。仙人掌粗多糖（Opuntia dillenii Haw.polysaccharides，ODPS）是仙人掌的主要活性成分之一，大量藥理學研究表明，其具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、提高免疫力和保肝護肝等生物活性[2-7]。

就文獻報道看來，仙人掌多糖的研究主要集中在提取工藝的優(yōu)化及其藥理作用的探討上，缺乏對其進行系統(tǒng)的、具體的結構描述[8-10]。因此，我們需要尋找確實有效的分離純化方法，目前一般采用離子交換層析的方法進行純化，但游離蛋白的存在勢必會影響到離子交換層析的效果以及多糖得率，因此必須去除其中的游離蛋白。本文以野生仙人掌為原料，探討不同方法的蛋白脫除率、多糖和抗氧化性損失率，為其進一步分級純化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

仙人掌 采自湛江東海島附近，經湛江師范學院的陳燕副教授鑒定為Opuntia dillenii Haw.；考馬斯亮藍G-250和阿拉伯糖 FLUKA BioChemika公司；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH） 美國Sigma公司；硫酸、磷酸、95%乙醇、三氯乙酸、氫氧化鈉、氯仿、正丁醇、乙酸 分析純；水 為超純水。

Beekman 360型精密pH計 USA Beekman Coulter INC.；日立牌CR22E型高速冷凍離心機 Japan Hitachi Co.；4.5 Liter Freeze Dry System American Labconco Inc.；TU-1800S型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；LABOROTA 4003-control型旋轉蒸發(fā)儀 Germany Heidolph Co.。

1.2 實驗方法

1.2.1 仙人掌粗多糖提取工藝 參照本實驗室Zhao等[11]的方法進行。新鮮仙人掌莖片除刺洗凈、切碎→80%食用酒精浸泡→干燥，粉碎過60目篩→熱水浸提→上清液→減壓濃縮→3倍體積95%乙醇醇沉→白色沉淀→凍干→粗多糖。

1.2.2 多糖含量的測定 采用苯酚硫酸法[12]，以阿拉伯糖作標準品。標準曲線：y=0.0185x-0.0068，R2= 0.9991。線性范圍為7.5～37.5μg/m L。

1.2.3 蛋白質含量的測定 采用考馬斯亮藍法[13]，以牛血清蛋白作標準品。標準曲線：y=0.0061x，R2= 0.9955。線性范圍為10～90μg/m L。

1.2.4 抗氧化性的測定 采用清除DPPH自由基的方法[14]。吸取樣品2.0m L于試管中，加入2.0m L 0.1mmol/L DPPH溶液，充分混勻，避光靜置30m in后，以50%乙醇調零，517nm波長測吸光值A樣品。同時，用50%乙醇代替DPPH溶液，測吸光值A對照；再用50%乙醇代替樣品，測吸光值A空白。

1.2.5 蛋白脫除率、多糖損失率及抗氧化性損失率的計算方法

1.2.6 仙人掌粗多糖的脫蛋白實驗

1.2.6.1 三氯乙酸（TCA）法 參照文獻[15]中的方法，取0.5%粗多糖溶液20m L分別加入等體積質量濃度為3%、6%、9%、12%、15%三氯乙酸溶液，攪拌均勻，4℃靜置12h，8000r/min離心15min去沉淀，上清液用NaOH調pH至中性，定容。重復操作3次。分別測多糖、蛋白質含量和抗氧化性。

1.2.6.2 Sevag法 參照文獻[16]中的方法，0.5%粗多糖溶液25m L與5m L Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1）混合，劇烈振蕩30m in，8000r/m in離心15m in，棄去中間沉淀和下層有機相，收集水相，定容。重復操作3次。測多糖、蛋白質含量和抗氧化性。分別處理1、2、3、4、5、6、7次。

1.2.6.3 蛋白質等電點法 參照文獻[17]中的方法，取20m L 0.5%粗多糖溶液，分別用乙酸調節(jié)pH至2.5、3.0、3.5、4.0和4.5，攪拌均勻，4℃靜置12h，8000r/m in離心15m in，上清液定容，重復操作3次。測多糖、蛋白質含量和抗氧化性。

2 結果與分析

2.1 三氯乙酸（TCA）法

由圖1可知，三氯乙酸濃度較小時，蛋白脫除率較高，但隨著濃度的增加，蛋白脫除率逐漸降低并趨于穩(wěn)定，而多糖損失率相應減小，這是可能是由于三氯乙酸與蛋白質結合生成的沉淀吸附了部分多糖導致的，而三氯乙酸并未將多糖降解為單糖。抗氧化性損失率隨濃度的增加呈大致上升趨勢，說明三氯乙酸濃度增加，對多糖降解越厲害，對其結構破壞越強。三氯乙酸濃度過低，也不能有效的沉淀蛋白。當三氯乙酸濃度為3%時，蛋白脫除率為80.28%，多糖損失率為5.98%，抗氧化性損失率為34.56%，此時，脫蛋白效果最好。

圖1 三氯乙酸法脫蛋白對多糖質量的影響Fig.1 Effect of trichloroacetic acidmethod on the quality of the polysaccharide

2.2 Sevag法

由圖2可以看出，隨著脫蛋白次數(shù)的增加，蛋白脫除率呈上升趨勢，但總的來說脫蛋白效果不是很好，進行7次脫蛋白處理，蛋白脫除率才達到58.30%。多糖損失率也隨之升高，達到了36.92%，這是因為每次脫蛋白處理都會造成一定的多糖損失。抗氧化性損失率基本上保持不變，但也較高。蛋白脫除率低于三氯乙酸法，抗氧化性損失率也略高于三氯乙酸法。由于Sevag法使用的試劑是氯仿和正丁醇，氯仿有毒，會造成多糖活性的下降，而且溶劑會有殘留，因此不宜用Sevag法脫蛋白。

圖2 Sevag法脫蛋白對多糖質量的影響Fig.2 Effectof Sevagmethod on the quality of the polysaccharide

2.3 蛋白質等電點法

由圖3可以看出，隨著糖液pH的升高，糖液中蛋白質脫除率逐漸增加然后降低，多糖損失率逐漸降低然后增加，抗氧化性損失率逐漸增加。用乙酸調節(jié)糖液pH為3.5時，蛋白質脫除率最高，達60.86%，說明pH 3.5是仙人掌多糖中雜蛋白的等電點，此時多糖損失率達到最低，為1.67%，抗氧化性損失率為30.09%?？寡趸該p失低于Sevag法和三氯乙酸法，可能是由于其反應較溫和，對多糖結構破壞較小。

2.4 3種方法中最佳脫蛋白方法的比較

由圖4可知，Sevag法脫蛋白多糖損失率最高，脫蛋白效果一般，抗氧化性損失率也略高于其他方法；三氯乙酸法和等電點法多糖損失率都較小，雖三氯乙酸法抗氧化性損失率略高于等電點法，但其脫蛋白效果卻遠高于等電點法。因此，可選擇三氯乙酸法脫蛋白。

圖3 蛋白質等電點法對多糖質量的影響Fig.3 Effectof the protein isoelectric pointmethod on the quality of the polysaccharide

圖4 三種脫蛋白方法效果的比較Fig.4 Effectof the comparison of three deproteinizationmethods

3 結論

實驗對比了三氯乙酸法、Sevag法和等電點法對仙人掌多糖脫蛋白的效果，其中，Sevag法需要重復多次操作，而且多糖損失較大，達到了36.92%；三氯乙酸法脫蛋白效率高，當濃度為3%時，蛋白脫除率為80.28%，多糖損失不明顯，只有5.98%，抗氧化性損失也不高；蛋白質等電點法脫蛋白效果一般，最佳效果只達到60.86%，多糖損失較小，而抗氧化性損失最小。對比以上方法，采用3%的三氯乙酸進行脫蛋白。

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