曹紅剛，范家恒，李亮梅，趙風云

（昆明理工大學(xué)食品工程研究中心，云南昆明650500）

草菇（Volvariella volvacea）又名稻草菇，國際上稱之為“中國蘑菇”，在熱帶和亞熱帶地區(qū)被廣泛栽培[1]。草菇子實體味道鮮美，營養(yǎng)豐富，深受消費者的喜愛[2-3]。草菇在菌種保藏和栽培過程中，通常使用化學(xué)藥物，如抗生素、甲醛、多菌靈等化學(xué)藥物控制其他微生物的污染[4]，這些化學(xué)藥物在抑制雜菌的同時，不免進入草菇子實體中，從而影響草菇的食用安全。蜂膠作為一種天然、無毒的廣譜抗菌劑，若將其代替化學(xué)藥物抑制草菇在菌種保藏和生產(chǎn)過程中的污染，可在一定程度上增強草菇的食用安全性。

蜂膠是西方蜜蜂（Apismellifera）采集植物樹脂，并混入蜂蠟、花粉及蜜蜂腺體分泌物后經(jīng)蜜蜂咀嚼加工而成的一種粘稠物質(zhì)[5]。蜜蜂利用蜂膠填補蜂巢空隙，光滑蜂巢內(nèi)壁，并利用蜂膠防止巢房內(nèi)異物的腐爛和病菌的傳染等[6]。黃酮類化合物是蜂膠中的重要生物學(xué)活性物質(zhì)[5]。研究發(fā)現(xiàn)蜂膠的抑菌活性[7]、殺蟲性[8]、抗氧化活性[9]等藥理學(xué)活性與其中的黃酮類化合物有密切關(guān)系，因此黃酮類化合物的含量常作為蜂膠質(zhì)量控制的一個重要的指標[10]。

Sawaya等發(fā)現(xiàn)不同提取方法和提取溶劑獲得的蜂膠，其化學(xué)成分存在差異，其抑菌活性各自不同[11]。由于黃酮類化合物多為脂溶性，本實驗采用75%的乙醇、95%的乙醇、75%的乙酸乙酯、95%的乙酸乙酯提取蜂膠中的活性成分，并對草菇及其污染菌進行抑制作用研究。以期得出蜂膠的提取方法、提取液濃度等因素對草菇及污染菌的抑制作用影響。作為一種天然抑菌劑，蜂膠已被用于果蔬、肉制品、乳品、雞蛋等食品的防腐保鮮[12-14]，然而，可否添加于草菇菌種和栽培生產(chǎn)中，延長菌種保藏，抑制雜菌污染，尚未見報道，本研究可為蜂膠的廣泛應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草菇V23 本實驗室保藏菌種；粗蜂膠 采自云南蒙自；馬鈴薯綜合培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA） 馬鈴薯20%，葡萄糖2%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.15%，瓊脂2%，pH自然；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（beef-protein agar medium，BPA） 牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉1.5%，瓊脂2%，pH自然。

AL204電子分析天平 中國梅特勒-托利多（上海）有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計日本島津公司；ES-315高壓滅菌鍋日本TOMY KOGYO公司；KQ-500DB超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 蜂膠提取工藝

1.2.1 蜂膠的提取 稱取適量粗蜂膠，置于-20℃下24h后，取出磨碎，稱取磨碎后的蜂膠10g，分別用40m L 75%的乙醇、95%的乙醇、75%的乙酸乙酯、95%的乙酸乙酯，在40℃下浸48h，離心取上清液，-2℃下保存待用。濾渣洗滌、干燥并稱重，計算可溶物含量和蜂膠提取液濃度。

蜂膠提取液濃度（mg/m L）=蜂膠總量（mg）×可溶物含量（%）/液總體積（m L）×100

1.2.2 黃酮含量的測定 蜂膠總黃酮含量的測定[15]：取蜂膠提取液1m L，加入1m L 5%NaNO3溶液，1m L 10%A l（NO3）3溶液，10m L 4.3%NaOH溶液，定容至25m L，搖勻，靜置15m in，于517nm下測吸光值。以蘆丁為標品做標準曲線。

1.3 草菇菌種污染菌的分離與初步鑒定

1.3.1 細菌 取草菇污染菌種接種于BPA平板，37℃培養(yǎng)24h，用接種環(huán)挑去少許細菌劃線分離，培養(yǎng)出單菌落，通過菌落大小、形態(tài)、色澤及染色、鏡檢進行菌種鑒定。

1.3.2 霉菌 取草菇污染菌種接種于PDA平板，28℃培養(yǎng)1～2d，因污染菌生長速度大于草菇，從霉菌菌絲末端切取新生菌絲接種于新PDA平板上，培養(yǎng)1～2d，通過菌落大小、形態(tài)、表面特征、菌絲色澤及染色、鏡檢進行菌種鑒定。

1.4 蜂膠提取液對草菇、霉菌及細菌的抑制作用

將4種蜂膠提取液用蒸餾水分別稀釋20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、400倍，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，收集濾液進行抑制實驗，實驗方法為：

1.4.1 草菇、霉菌 吸取1m L蜂膠稀釋液用無菌L棒涂布于PDA平板，接種活化后的草菇或青霉菌，28℃恒溫培養(yǎng)，對照組為相應(yīng)的含有相同量的乙酸乙酯水或乙醇水，72h后測定菌落直徑，每組實驗設(shè)三個平行，計算抑制率。

1.4.2 細菌 制備濃度為1×106CFU的細菌菌懸液，涂布于BPA平板上，37℃恒溫培養(yǎng)，待其長滿培養(yǎng)基后，取直徑約為6mm的菌塊，接種至涂布有蜂膠稀釋液的BPA平板上，對照組為相應(yīng)的含有相同量的乙酸乙酯水或乙醇水，48h后測定抑菌圈直徑，每組實驗設(shè)三個平行，計算抑制率。

抑制率（%）=[對照組菌落直徑（mm）-實驗組菌落直徑（mm）]/對照組菌落直徑（mm）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度乙醇和乙酸乙酯對蜂膠可溶物和黃酮含量的影響

本實驗采用75%乙醇、95%乙醇、75%乙酸乙酯、95%乙酸乙酯浸提粗蜂膠，測定其可溶物含量、黃酮含量。以蘆丁作為標品，繪制標準曲線得出回歸方程為y=10.95x-0.0042，R2=0.9997，依據(jù)此方程可求出黃酮含量。結(jié)果如表1所示，95%乙酸乙酯提取的蜂膠可溶物含量為60.3%，黃酮含量為6.23mg/m L，均顯著高于其他3個溶劑（p＜0.05），而75%和95%的乙醇提取液的可溶物含量和黃酮含量之間的差異不顯著（p＞0.05）。

黃酮類化合物是蜂膠中重要的活性成分，其種類繁多，結(jié)構(gòu)與性質(zhì)不同，在不同溶劑中的溶解性也不同。Vardar-Unlu G等認為提取溶劑的選擇蜂膠提取物的成分有重要影響[16]。本實驗中相同濃度的乙酸乙酯與乙醇，乙酸乙酯的提取效果優(yōu)于乙醇提取效果，根據(jù)相似相溶原理，可初步推斷云南蒙自蜂膠中含有較多極性較弱的黃酮類化合物。

表1 乙醇與乙酸乙酯的蜂膠提取成分對比Table1 Comparison of propolis extractby ethanol and ethyl acetate

本實驗中提取的蜂膠液中黃酮含量為4.92～6.23mg/m L。胡福良等[17]、唐坤等[18]提取市售商品蜂膠中黃酮，其含量分別為51.4mg/m L和41.61mg/g，顯著高于本實驗的黃酮含量。其原因可能是：本實驗采用的原料是采自云南蒙自蜂場的未加工的粗蜂膠，含有較多的蜂蠟等雜質(zhì)，可溶物含量僅為48.1%～60.3%，使得提取液中的黃酮類化合物的含量偏低；蜂膠提取液中的黃酮類化合物的種類、含量與蜂膠來源、提取試劑、測定方法等因素有關(guān)，也會造成不同實驗的測定數(shù)據(jù)有一定的差異性。

2.2 草菇污染菌的初步鑒定結(jié)果

2.2.1 細菌的形態(tài)特征 37℃培養(yǎng)24h，菌落直徑為1～5mm，乳白色，不透明，邊緣不規(guī)則，表面干燥粗糙、無隆起；經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，菌體呈陽性，短桿狀。

對該細菌的菌落特征和顯微特征初步鑒定為革蘭氏陽性桿菌。

2.2.2 霉菌形態(tài)特征 28℃培養(yǎng)2d，菌落直徑為0.5～ 1cm，剛長出菌落為淡黃色，隨菌落生長，中心出現(xiàn)墨綠色并向上突起，擴展過程中菌落邊緣有一圈白色菌絲；正反顏色不同，背面為淺黃色；菌落生長致密、不透明、干燥；隨菌落生長，白色菌絲消失，最終為墨綠色。

對菌株進行染色、制片，顯微鏡檢特征為菌絲無色，分生孢子梗單枝，較長，無足細胞，有橫膈膜；孢子梗頂端不膨大，排列成帚狀的間枝，分支1次或2次，對稱，頂層為小梗，上生分生孢子串，分生孢子串呈不分枝的鏈狀；帚狀枝較短，排列緊密。單個分生孢子為球形或橢圓形，紫紅色。

對該霉菌的菌落特征和顯微特征初步鑒定為叢梗孢科（Moniliaceae），青霉屬（Penicillium）。

2.3 蜂膠提取液對草菇及其污染菌的抑菌作用

將4種蜂膠提取液用蒸餾水進行梯度稀釋，得到稀釋液的蜂膠提取液濃度如表2所示。

表2 4種蜂膠在不同稀釋度下的蜂膠提取液濃度（mg/mL）Table2 The concentration of 4 kinds of propolis extraction in different dilutions（mg/mL）

圖1 75%乙醇提取液對草菇、霉菌、細菌的抑制曲線Fig.1 Inhibition curve of propolis extract by 75%ethanol on V.volvacea，bacteria andmould

由圖1～圖4可知，蜂膠提取液對草菇、霉菌和細菌的抑制作用趨勢相似，隨著稀釋倍數(shù)的增加，蜂膠提取液對草菇、霉菌、細菌的抑制作用逐漸減弱；相同濃度的蜂膠液對草菇、霉菌及細菌的抑制作用強弱順序為細菌＞草菇＞霉菌。進一步比較4種蜂膠提取液的抑菌作用發(fā)現(xiàn)，95%乙酸乙酯蜂膠提取液抑菌效果較優(yōu)。由圖4可知，蜂膠液在60倍（2.5mg/m L）的稀釋度下，對細菌的抑制率為100%（致死）；在20倍（7.5mg/m L）的稀釋度下，對草菇是致死的；蜂膠提取液原液對霉菌的抑制率為72.83%，高于其他3種提取液的抑制效果（p＞0.05）。

圖2 95%乙醇提取液對草菇、霉菌、細菌的抑制曲線Fig.2 Inhibition curve of propolis extract by 95%ethanol on V.volvacea，bacteria andmould

圖3 75%乙酸乙酯提取液對草菇、霉菌、細菌的抑制曲線Fig.3 Inhibition curve of propolis extractby 75%ethyl acetate on V.volvacea，bacteria and mould

圖4 95%乙酸乙酯提取液對草菇、霉菌、細菌的抑制曲線Fig.4 Inhibition curve of propolis extractby 95%ethyl acetate on V.volvacea，bacteria and mould

抑菌實驗表明，相同濃度的蜂膠浸提液對草菇及污染菌的抑制作用不同，其抑制作用強弱順序為細菌＞草菇＞霉菌，因此在草菇的栽培過程中，添加適量的蜂膠提取液可有效抑制細菌的污染，但對控制霉菌的污染效果不夠顯著。這與楊艷彬等[19]的研究結(jié)果一致，蜂膠提取液對細菌的抑制作用更明顯。

2.4 黃酮含量與抑菌作用的相關(guān)性分析

對蜂膠提取液中的黃酮含量和草菇及污染菌的抑菌作用進行相關(guān)性分析。由表3可知，草菇、霉菌和細菌的抑制率與黃酮含量的相關(guān)系數(shù)均大于0.9，說明黃酮含量和抑菌效果有較強的相關(guān)性，黃酮含量越高，抑菌效果越強；與Pepeljnjak等得出的蜂膠抗菌效果和蜂膠中黃酮類物質(zhì)含量成正比的結(jié)論一致[20]。也進一步驗證了黃酮類物質(zhì)是一種重要的抗菌活性成分。

表3 蜂膠提取液中黃酮含量與抑菌作用的相關(guān)性分析Table3 Correlations analysis between antimicrobial effectand flavonoid content

3 結(jié)論

本研究以云南蒙自的粗蜂膠為材料，采用75%乙醇、95%乙醇、75%乙酸乙酯、95%乙酸乙酯浸提，測定蜂膠提取液的黃酮含量，并進行草菇及分離獲得的污染菌的抑制作用研究。結(jié)果表明：分離獲得的草菇污染菌初步鑒定為革蘭氏陽性細菌和青霉屬菌。95%乙酸乙酯提取效果優(yōu)于其他三種溶劑（p＜0.05），4種蜂膠提取液對草菇及污染菌均有一定的抑制作用，抑制強弱為細菌＞草菇＞霉菌。相關(guān)性分析表明，草菇、霉菌和細菌的抑制率與黃酮含量的相關(guān)系數(shù)均大于0.9，有較強的相關(guān)性。本研究表明，蜂膠提取液可以有效抑制草菇的生長速度，添加適量蜂膠液能適當延緩草菇菌種的退化速度。同時，將適量的蜂膠提取液代替合成的抗生素、殺菌劑等，應(yīng)用于草菇的栽培生產(chǎn)、子實體保鮮及菌種保藏中，可有效抑制細菌污染，有一定的應(yīng)用意義。

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