■姜軍坡 范會(huì)蘭 王世英

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071001）

腹瀉是犢牛的一種最常見的疾病，以黏膜發(fā)炎、糜爛、壞死和腹瀉為特征，是小牛死亡的最常見病因[1-2]。研究表明，腹瀉是腸道菌群失調(diào)的必然結(jié)果，腹瀉時(shí)，直腸中的大腸桿菌數(shù)明顯增加，腹瀉康復(fù)時(shí)則相反[3]。腸道益生菌能幫助動(dòng)物建立協(xié)調(diào)的胃腸道微生物區(qū)系，有效預(yù)防腹瀉，同時(shí)還可促進(jìn)動(dòng)物的生長發(fā)育，提高飼料利用率[4]。芽孢桿菌是微生態(tài)益生菌制劑的一種常用菌種[5]，由于芽孢桿菌型益生菌產(chǎn)品大多采用芽孢形式的菌體，對(duì)不良環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，能有效緩解益生菌在使用、生產(chǎn)、運(yùn)輸、保存過程中失效的問題，因而受到人們的日益關(guān)注。

在微生物培養(yǎng)基的優(yōu)化過程中，利用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析，可以簡化試驗(yàn)步驟，避免主觀臆斷并提高準(zhǔn)確性[6]。劉俏等[7]以青霉素發(fā)酵為例，采用MATLAB軟件對(duì)其發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化，得到了青霉素發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基配比，其優(yōu)化過程極為簡便。鄭毅等[8]采用二水平Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法（Response surface methodology）快速優(yōu)化產(chǎn)木聚糖酶的液體培養(yǎng)基組成，從眾多因素中篩選出重要因子，準(zhǔn)確指明最佳控制條件。

BN-10菌株是從健康牛的糞便中篩選出的一株對(duì)大腸桿菌有強(qiáng)烈抑制作用的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。前期研究發(fā)現(xiàn)，BN-10菌株發(fā)酵液去菌體后仍然可以抑制大腸桿菌，但是若再經(jīng)121℃熱處理，則會(huì)喪失其對(duì)大腸桿菌的抑制活性；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液去菌體后的硫酸銨沉淀物可以抑制大腸桿菌，但是發(fā)酵液去菌體后的氯仿提取物對(duì)大腸桿菌沒有抑制活性；故初步判斷BN-10菌株能夠抑制大腸桿菌的胞外產(chǎn)物為蛋白質(zhì)。因此，本文對(duì)BN-10菌株細(xì)胞外產(chǎn)蛋白條件進(jìn)行了研究，采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行分析，以獲得產(chǎn)生較多胞外抑菌蛋白的條件，為進(jìn)一步研究該菌株所產(chǎn)胞外抗菌蛋白的性質(zhì)奠定基礎(chǔ)，以便從分子水平研究該菌株的安全性問題。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器

ZHWY-2112B型雙層搖床(上海智誠分析儀器有限公司)、GL-20G-II型高速冷凍離心機(jī)(上海安亭實(shí)驗(yàn)儀器總廠)。

1.1.2 菌株

病原菌：大腸桿菌（Escherichia coli）一株，由河北大學(xué)贈(zèng)送。

拮抗細(xì)菌：解淀粉芽孢桿菌BN-10菌株，由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.3 培養(yǎng)基

芽孢桿菌NA培養(yǎng)基組成參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[9]。NB培養(yǎng)基為NA的液體形式，即不向其中加瓊脂。

大腸桿菌LB培養(yǎng)基組成參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[9]。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨2%、蔗糖2%、NaH2PO4·2H2O 0.1%、Na2HPO4·2H2O 0.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.02%，pH值7.0～7.2。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基同種子培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 BN-10菌株種子液培養(yǎng)

將斜面培養(yǎng)的BN-10菌株接種于裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中。于200 r/min、37℃，搖床培養(yǎng)12 h后使用，搖瓶容量為250 ml，裝瓶量為100 ml。

1.2.2 BN-10菌株產(chǎn)胞外抗菌蛋白活性的測定

將BN-10菌株轉(zhuǎn)接NA斜面，活化12 h后，按6.0%的接種量接種于裝瓶量為100 ml/250 ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，200 r/min、37℃下培養(yǎng)48 h。發(fā)酵培養(yǎng)基根據(jù)試驗(yàn)需要配制。

將E.coli接種于NA斜面，37℃培養(yǎng)24 h，加入5 ml滅菌去離子水，輕輕刮下菌絲，充分振蕩混勻，制成含大腸桿菌的懸浮液，然后將其加入100 ml融化冷卻至50℃左右的NA培養(yǎng)基中，搖勻，倒入滅菌平皿中，制成含E.coli瓊脂平板。待E.coli平板凝固后，選擇合適的間距用打孔器在上面打孔，并向每個(gè)小孔內(nèi)分別加入50 μl已離心除菌體的BN-10菌株發(fā)酵液，靜置30 min后，于恒溫箱中37℃培養(yǎng)24 h，測量所產(chǎn)生的抑菌圈面積。抑菌圈的面積可以表征發(fā)酵液中抗菌蛋白的產(chǎn)量。

1.2.3 培養(yǎng)基組成對(duì)BN-10菌株產(chǎn)抗菌蛋白影響的測定

1.2.3.1 無機(jī)鹽種類對(duì)BN-10菌株產(chǎn)抗菌蛋白影響的測定

分 別 以 MnSO4、FeSO4、KCl、NaCl、MgSO4·7H2O、CaCl2、ZnSO4作為發(fā)酵液的不同無機(jī)鹽，含量均為0.05%；添加NaH2PO4·2H2O 0.1%、Na2HPO4·2H2O 0.2%作為緩沖物質(zhì)；氮源為蛋白胨，含量2%；碳源為蔗糖，含量2%。分別測量發(fā)酵產(chǎn)抗菌蛋白的抑菌圈面積。

1.2.3.2 氮源種類對(duì)BN-10菌株產(chǎn)抗菌蛋白影響的測定

分別以蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、黃豆粕粉、牛肉膏、酪蛋白胨、尿素、硫酸銨作為發(fā)酵液的不同氮源，含量均為2%；碳源為蔗糖，含量2%；無機(jī)鹽為2種，依據(jù)試驗(yàn)而確定，含量均為0.05%；添加NaH2PO4·2H2O 0.1%、Na2HPO4·2H2O 0.2%作為緩沖物質(zhì)。分別測量發(fā)酵產(chǎn)抗菌蛋白的抑菌圈面積。

1.2.3.3 碳源種類對(duì)BN-10菌株產(chǎn)抗菌蛋白影響的測定

分別以玉米粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、糊精、甘露醇、麥芽糖作為發(fā)酵液的不同碳源，含量均為2%；氮源依據(jù)試驗(yàn)而確定，含量2%；無機(jī)鹽為2種，依據(jù)試驗(yàn)而確定，含量均為0.05%；添加NaH2PO4·2H2O 0.1%、Na2HPO4·2H2O 0.2%作為緩沖物質(zhì)。分別測量發(fā)酵產(chǎn)抗菌蛋白的抑菌圈面積。

1.2.3.4 BN-10菌株發(fā)酵培養(yǎng)基組成的正交優(yōu)化

按正交試驗(yàn)L16(45)設(shè)計(jì)5因素各4個(gè)水平試驗(yàn)，根據(jù)上述試驗(yàn)確定的最適碳源、氮源、無機(jī)鹽配制不同組成的培養(yǎng)基。分別測量發(fā)酵產(chǎn)抗菌蛋白的抑菌圈面積。采用SPSS軟件對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差（Range）分析和一般線性模型（General Linear Model，GLM）分析，以得出最佳培養(yǎng)基組成。若優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基組成未在正交表中出現(xiàn)，則平行測定最佳培養(yǎng)基和正交表中最佳組成對(duì)應(yīng)的抑菌圈面積，重復(fù)6次，進(jìn)行比較。

1.2.4 發(fā)酵條件對(duì)BN-10菌株產(chǎn)抗菌蛋白影響的測定

培養(yǎng)基組成優(yōu)化完成后，根據(jù)所得結(jié)果配制培養(yǎng)基，按正交試驗(yàn)L16(45)設(shè)計(jì)5因素各4個(gè)水平試驗(yàn)。分別測量發(fā)酵產(chǎn)抗菌蛋白的抑菌圈面積。采用SPSS軟件對(duì)發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析和一般線性模型分析，以確定最佳發(fā)酵條件。若優(yōu)化的最佳發(fā)酵條件未在正交表中出現(xiàn)，則平行測定最佳發(fā)酵條件和正交表中最佳組成對(duì)應(yīng)的抑菌圈面積，重復(fù)6次，進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基組成對(duì)BN-10菌株產(chǎn)抗菌蛋白的影響

2.1.1 無機(jī)鹽種類對(duì)BN-10菌株產(chǎn)抗菌蛋白的影響（見圖1）

由圖1可知，以ZnSO4和KCl作為培養(yǎng)基的無機(jī)鹽時(shí)，產(chǎn)生的抑菌圈較大，相對(duì)應(yīng)的抗菌蛋白產(chǎn)量較高。故選用ZnSO4（無機(jī)鹽Ⅰ）和KCl（無機(jī)鹽Ⅱ）作為BN-10菌株產(chǎn)抗菌蛋白培養(yǎng)基的無機(jī)鹽。

圖1 無機(jī)鹽對(duì)Bacillus amyloliquefaciens BN-10菌株產(chǎn)抗菌蛋白的影響

2.1.2 氮源種類對(duì)BN-10菌株產(chǎn)抗菌蛋白的影響（見圖2）

圖2 氮源對(duì)Bacillus amyloliquefaciens BN-10菌株產(chǎn)抗菌蛋白的影響

采用8種不同的氮源對(duì)BN-10菌株發(fā)酵產(chǎn)抗菌蛋白量進(jìn)行考察，結(jié)果表明，以尿素和硫酸銨為氮源時(shí)無抑菌圈，而在其余的6種氮源中，以酪蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨、黃豆粕粉為氮源時(shí)抑菌圈較大，相應(yīng)的抗菌蛋白產(chǎn)量較高。考慮到黃豆粕粉和酪蛋白胨所對(duì)應(yīng)的抑菌圈面積大小沒有顯著區(qū)別，但是黃豆粕粉價(jià)格低廉，可以降低生產(chǎn)成本，最終選用黃豆粕粉作為BN-10菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

2.1.3 碳源種類對(duì)BN-10菌株產(chǎn)抗菌蛋白的影響（見圖3）

圖3 碳源對(duì)Bacillus amyloliquefaciens BN-10菌株產(chǎn)抗菌蛋白的影響

由圖3可知，產(chǎn)抗菌蛋白最多的3種碳源，從大到小依次為玉米粉、甘露醇和蔗糖，且由圖3可知，這三者之間并沒有顯著差別。從原料價(jià)格因素出發(fā)，采用玉米粉最佳，但是以玉米粉作為碳源，還需考慮玉米粉的液化問題，這會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵工藝復(fù)雜化，也間接導(dǎo)致成本的增加；而以蔗糖為碳源，其價(jià)格適中，發(fā)酵成本較低，故最終采用蔗糖作為BN-10菌株發(fā)酵產(chǎn)抗菌蛋白培養(yǎng)基的碳源。

2.1.4 培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

改變蔗糖、黃豆粕粉、ZnSO4和KCl的含量，進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表1。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析和GLM分析，分別如表2和表3所示。由表2可知，各因素水平對(duì)結(jié)果影響的強(qiáng)弱順序?yàn)?A2＞A1＞A4＞A3、B4＞B3＞B2＞B1、C1＞C2＞C3＞C4、D2＞D4＞D3＞D1，各因素的主次順序?yàn)锽＞C＞A＞D，即黃豆粕粉＞ZnSO4＞蔗糖＞KCl。由表3可知，因素B和C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），而因素A和D對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不大，即ZnSO4和氮源的濃度變化對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響較為顯著。由極差分析可知，培養(yǎng)基正交試驗(yàn)優(yōu)化出來的最佳配方為A2B4C1D2，但由于組成為A2B4C1D2的培養(yǎng)基未在正交試驗(yàn)中出現(xiàn)，故應(yīng)與正交試驗(yàn)各個(gè)培養(yǎng)基中產(chǎn)抗菌蛋白量最高者進(jìn)行比較，即與組成為A4B4C1D3的培養(yǎng)基進(jìn)行比較（見表4）。同法操作下，組成為A2B4C1D2的培養(yǎng)基，其平均抑菌圈面積為3.347 cm2（n=6）；組成為A4B4C1D3的培養(yǎng)基，其平均抑菌圈面積為3.017 cm2（n=6）。比較試驗(yàn)表明，正交試驗(yàn)優(yōu)化出的培養(yǎng)基組成對(duì)應(yīng)的抑菌圈面積最高，其對(duì)應(yīng)的組成為蔗糖含量為2%、黃豆粕粉為5%、ZnSO4含量為0.01%、KCl含量為0.02%。

表1 培養(yǎng)基組成正交試驗(yàn)方案與結(jié)果

表2 培養(yǎng)基組成正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析（cm2）

表3 培養(yǎng)基組成正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

表4 培養(yǎng)基組成正交優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果

2.2 發(fā)酵條件對(duì)BN-10菌株產(chǎn)抗菌蛋白的影響

改變發(fā)酵時(shí)間、裝瓶量、接種量、培養(yǎng)基初始pH值，進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表5。對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析和GLM分析，分別如表6和表7所示。由表6可知，各因素水平對(duì)結(jié)果影響的強(qiáng)弱順序?yàn)锳4＞A2＞A3＞A1、B1＞B2＞B3＞B4、C1＞C2＞C4＞C3、D1＞D4＞D2＞D3，各因素的主次順序?yàn)檠b瓶量＞接種量＞培養(yǎng)基初始pH值＞發(fā)酵時(shí)間。由表7可知，因素B對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），而因素A、C和D均對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著，即裝瓶量的變化對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響顯著。由極差分析可知，最佳的發(fā)酵條件為A4B1C1D1，但由于發(fā)酵條件A4B1C1D1未在正交試驗(yàn)中出現(xiàn)，故應(yīng)與正交試驗(yàn)各個(gè)發(fā)酵條件中產(chǎn)抗菌蛋白量最高者進(jìn)行比較，即發(fā)酵條件A1B1C1D1進(jìn)行比較（見表8）。同法操作下，發(fā)酵條件A4B1C1D1對(duì)應(yīng)的平均抑菌圈面積為3.871cm2（n=6）；發(fā)酵條件A1B1C1D1對(duì)應(yīng)的平均抑菌圈面積為3.347cm2（n=6）。通過比較可知，BN-10菌株在發(fā)酵條件A4B1C1D1下比在發(fā)酵條件A1B1C1D1下產(chǎn)蛋白量大，但是兩個(gè)發(fā)酵條件的差異僅在于發(fā)酵時(shí)間不同，兼顧效率，最終采用發(fā)酵條件A1B1C1D1作為最佳發(fā)酵條件，即發(fā)酵時(shí)間24 h、裝瓶量30 ml/250 ml，接種量2%，培養(yǎng)基初始pH值為6.0。

表5 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)方案與結(jié)果

表6 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析（cm2）

3 討論與結(jié)論

BN-10菌株產(chǎn)生的胞外蛋白抑制大腸桿菌的活性和抑菌圈面積有一定相關(guān)性，因而可以借助抑菌圈的面積來評(píng)價(jià)胞外蛋白的活性。培養(yǎng)基組成是影響菌株發(fā)酵產(chǎn)胞外蛋白的主要因素，適宜的發(fā)酵條件也是一個(gè)至關(guān)重要的影響因素，通過優(yōu)化菌株的培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件，可以充分發(fā)揮菌株的抑菌潛力[10]。通過培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵條件優(yōu)化，胞外蛋白對(duì)大腸桿菌的抑菌圈面積由2.3 cm2增大3.8 cm2，增幅達(dá)65.2%。由于抑菌圈面積和胞外蛋白的效價(jià)對(duì)數(shù)值成線性關(guān)系，這表明通過培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件的優(yōu)化可以極大地提高胞外蛋白的產(chǎn)量。以提高胞外抑菌蛋白產(chǎn)量為前提，同時(shí)兼顧效率，當(dāng)培養(yǎng)基組成為蔗糖2%、黃豆粕粉5%、ZnSO40.01%、KCl 0.02%，初始pH值6.0，種子液按2%接種量接種至裝瓶量為30 ml/250 ml的三角瓶中，200 r/min、37℃培養(yǎng)24 h后，可獲得較多的BN-10菌株的胞外蛋白。

表7 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

表8 發(fā)酵條件正交優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果

對(duì)于影響因素較多的試驗(yàn)而言，正交試驗(yàn)具有設(shè)計(jì)簡便、節(jié)省試驗(yàn)單元、統(tǒng)計(jì)效率高等特點(diǎn)。借助SPSS軟件的強(qiáng)大統(tǒng)計(jì)功能，既可以避免采用極差分析造成的對(duì)結(jié)果的錯(cuò)誤臆斷，又可以對(duì)正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行快速、直觀、精確的分析，從而提高工作效率[11-12]。本文借助SPSS軟件對(duì)培養(yǎng)基組成正交試驗(yàn)和發(fā)酵條件正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析表明，顯著影響B(tài)N-10菌株胞外蛋白產(chǎn)量的因素主要是氮源（黃豆粕粉）的濃度、無機(jī)鹽（ZnSO4）濃度和裝瓶量。

本文對(duì)BN-10菌株發(fā)酵產(chǎn)胞外抗菌蛋白的培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后抗菌蛋白的產(chǎn)量大幅提高，達(dá)到了預(yù)期的目的，有利于抗菌蛋白的大量制備和分離純化，為抗菌蛋白的性質(zhì)研究奠定了基礎(chǔ)。