■ 劉婉盈鄧 波 徐子偉 李 偉,3

（1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 310021；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇南京 210095）

鋅是動(dòng)物所必需的微量元素之一，動(dòng)物體內(nèi)適宜的鋅水平對(duì)維持動(dòng)物的生長、發(fā)育和免疫功能起著非常重要的作用。對(duì)畜牧生產(chǎn)來說，如果飼料中不添加額外的鋅，動(dòng)物很可能發(fā)生原發(fā)性和繼發(fā)性缺鋅。缺鋅將導(dǎo)致細(xì)胞免疫損傷、DNA氧化損傷、線粒體功能紊亂，最重要的是導(dǎo)致細(xì)胞過早老化。研究發(fā)現(xiàn)，鋅與金屬硫蛋白之間存在密切的聯(lián)系，主要是鋅可以直接調(diào)控金屬硫蛋白基因的表達(dá)，而金屬硫蛋白直接調(diào)節(jié)體內(nèi)鋅的吸收和代謝，維持體內(nèi)鋅的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。動(dòng)物體內(nèi)金屬硫蛋白（Metallothionein,MT）含量偏低，將使得細(xì)胞對(duì)凋亡因子更敏感，這說明MT影響信號(hào)通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，也間接說明鋅對(duì)體內(nèi)新陳代謝和細(xì)胞凋亡的影響。因此本文綜述了MT與鋅代謝的關(guān)系和鋅對(duì)不同動(dòng)物金屬硫蛋白表達(dá)的影響，為深入了解鋅的作用提供參考。

1 金屬硫蛋白

1957年，由Margoshes和Vallee在馬腎皮質(zhì)中首次分離出了金屬硫蛋白（Metallothionein,MT）。MT是一種富含半胱氨酸、低分子量的蛋白質(zhì)，它與鋅和其它重金屬有較強(qiáng)的親和力，可以由很多因素誘導(dǎo)產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，脊椎動(dòng)物的MT基因有一個(gè)或者多個(gè)同源序列，不同的動(dòng)物含有的MT同源基因的數(shù)量并不一致。同一個(gè)種屬，不同動(dòng)物的MT基因也不同，如雞、鴨、火雞等，擁有相同的MT基因，而鳥屬中的鴿子、鵪鶉就分別擁有兩個(gè)MT同源基因。不同功能的同源基因翻譯出不同的蛋白亞型(MT異構(gòu)體)。哺乳動(dòng)物的MT有4種異構(gòu)體：MT-1、MT-2、MT-3和MT-4。其中MT-1和MT-2在動(dòng)物的肝臟、胰臟、腎臟和小腸等組織中表達(dá)豐富；MT-3主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，MT-4主要分布在皮膚、舌、消化道等的角質(zhì)細(xì)胞和復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞中。哺乳動(dòng)物金屬硫蛋白一般由61～68個(gè)氨基酸組成，含有21個(gè)半胱氨酸殘基，其三級(jí)結(jié)構(gòu)式由α和β兩個(gè)球狀金屬結(jié)構(gòu)域組成。MT在細(xì)胞代謝中涉及多種功能，如：轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存金屬離子、解毒金屬離子富集產(chǎn)生的細(xì)胞毒害作用、離子的體內(nèi)平衡、自由基清除、免疫應(yīng)答和對(duì)抗疾病。

2 MT與鋅代謝的關(guān)系

MT結(jié)合某些金屬離子，因此，避免了金屬離子的毒性。如果體內(nèi)自由鋅離子濃度提高，就會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的錯(cuò)折疊，并且通過對(duì)線粒體的作用產(chǎn)生細(xì)胞毒性，引起氧化應(yīng)激。

無金屬結(jié)合的MT稱為硫蛋白(thionein)，其高級(jí)結(jié)構(gòu)為無序結(jié)構(gòu)，但一旦結(jié)合金屬離子，就會(huì)改變構(gòu)象，折疊成有序的結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞內(nèi)不同位置均發(fā)現(xiàn)MT的存在，MT涉及從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)鋅離子至細(xì)胞核內(nèi)，用于細(xì)胞增殖，或者使鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體的膜間隙，用于調(diào)節(jié)呼吸作用。MT同時(shí)也存在于細(xì)胞外間隙中，細(xì)胞通過內(nèi)吞途徑，使攜帶著金屬離子的MT進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。MT可調(diào)控鋅的自穩(wěn)態(tài)，而體內(nèi)攝入的鋅也影響組織中MT的含量。

鋅及其蛋白質(zhì)配體的相互作用取決于MT中半胱氨酸的硫基，MT以Zn3S9和Zn4S11兩個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合鋅。然而，對(duì)鋅的親和力而言，不同結(jié)合部位相差很大的數(shù)量級(jí)。7個(gè)鋅離子與巰基的結(jié)合力是不同的，其中4個(gè)鋅離子結(jié)合力最強(qiáng)(logK=11.8)，2個(gè)鋅離子結(jié)合力偏弱(logK≈10)，1個(gè)鋅離子結(jié)合力最弱(logK=7.7)，這個(gè)發(fā)現(xiàn)說明結(jié)合MT的鋅具有動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定性。MT對(duì)鋅代謝的影響是通過半胱氨酸巰基可逆的氧化還原反應(yīng)釋放或者結(jié)合鋅離子來調(diào)節(jié)的，所以MT起到了緩沖體內(nèi)鋅的能力，使體內(nèi)自由鋅濃度在一個(gè)穩(wěn)定范圍內(nèi)，而其他含鋅蛋白由于鋅在體內(nèi)總是以二價(jià)形式存在，氧化還原能力不活潑。在對(duì)鋅的吸收利用上，有研究證明，MT和另一種含巰基的蛋白CRIP（半胱氨酸豐富蛋白）共同負(fù)責(zé)結(jié)合腸道中的鋅，調(diào)節(jié)鋅的吸收，小腸MT的水平與鋅的吸收呈明顯的反比關(guān)系。

3 鋅對(duì)不同動(dòng)物MT表達(dá)的影響

研究發(fā)現(xiàn)，鋅可影響腸道和肝臟中基因的表達(dá)，促進(jìn)生長。金屬硫蛋白(MT)具有促進(jìn)細(xì)胞生長、發(fā)育的功能。在腸道黏膜細(xì)胞中，鋅的吸收受MT的調(diào)節(jié)，而日糧鋅濃度可以刺激腸道和肝臟中MT-mRNA的表達(dá)。MT與腸細(xì)胞內(nèi)鋅結(jié)合配體相競(jìng)爭(zhēng)，控制著跨基膜轉(zhuǎn)運(yùn)入循環(huán)系統(tǒng)中鋅的數(shù)量。日糧鋅濃度升高，則各組織器官中MT濃度也隨之升高，其調(diào)控機(jī)理可能是通過第二信使轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的，鋅與金屬反應(yīng)元件轉(zhuǎn)錄因子(MTF)結(jié)合，識(shí)別MT基因啟動(dòng)子上的特異序列金屬反應(yīng)元件(MRE)，并結(jié)合到DNA序列上，從而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。有研究發(fā)現(xiàn)，在雞飼料中添加鋅可以使雞肝Zn和Zn-MT含量明顯增加，這說明雞體內(nèi)Zn的儲(chǔ)備主要是通過Zn-MT的形式實(shí)現(xiàn)的。Carlson等推測(cè)腸細(xì)胞內(nèi)鋅的增加和MT一起可能有利于蛋白質(zhì)的合成和細(xì)胞的分裂增殖，從而促進(jìn)腸道健康，促進(jìn)動(dòng)物生長。鋅對(duì)不同動(dòng)物和不同組織MT及MT-mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)能力不同，下面分別介紹不同動(dòng)物受鋅誘導(dǎo)組織中MT表達(dá)受到的影響。

3.1 鋅對(duì)家禽MT表達(dá)的影響

黎云等采用RT-PCR(引物設(shè)計(jì)見表1)方法研究?jī)煞N鋅源對(duì)艾維茵肉仔雞肝臟MT-mRNA基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明，日糧中添加60 mg/kg的硫酸鋅和氨基酸絡(luò)合鋅均能提高肉仔雞肝臟MT-mRNA的豐度，但與硫酸鋅相比，日糧中添加氨基酸鋅顯著提高了肝臟MT-mRNA基因表達(dá)的水平(P＜0.05)。

表1 家禽MT和內(nèi)參基因的上下游引物序列

李發(fā)弟等也采用了RT-PCR方法（引物設(shè)計(jì)見表1）檢測(cè)不同鋅添加水平對(duì)蛋雞肝臟和腎臟中MT-mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明：基礎(chǔ)飼糧中添加60 mg/kg鋅可顯著提高成年蛋雞肝臟中MT基因的表達(dá)水平，而對(duì)腎臟中MT-mRNA的表達(dá)無顯著性影響，提示鋅調(diào)節(jié)組織中MT的基因表達(dá)和蛋白合成并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性關(guān)系，且其影響具有組織特異性。丁小波等研究發(fā)現(xiàn)，含鋅40、60 mg/kg的納米氧化鋅組能顯著提高肝臟中MT的生成量(P＜0.05)。以上試驗(yàn)說明硫酸鋅或氨基酸絡(luò)合鋅的添加量為60 mg/kg時(shí)，能有效地提高雞機(jī)體金屬硫蛋白的表達(dá)。

3.2 鋅對(duì)哺乳動(dòng)物MT表達(dá)的影響

徐振華等報(bào)道，分別以硫酸鋅和蛋氨酸鋅形式添加40、80、120 mg/kg鋅對(duì)2～3月齡生長肉兔金屬硫蛋白表達(dá)（引物設(shè)計(jì)見表2）的影響，隨著日糧鋅水平的增加，肝臟、腎臟MT-1mRNA相對(duì)表達(dá)豐度呈先升高后降低趨勢(shì)，且80 mg/kg添加水平時(shí)兩種鋅源MT-1mRNA相對(duì)表達(dá)豐度均達(dá)到最高。

表2 哺乳動(dòng)物MT和內(nèi)參基因的上下游引物序列

許梓榮等發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加3 000 mg/kg鋅(氧化鋅)，顯著提高了仔豬肝臟組織中MT的含量，其中3 000 mg/kg鋅(氧化鋅)組肝臟MT含量是對(duì)照組(100 mg/kg)的13倍。Lopez-Alonson等研究了鎘、銅、鋅對(duì)豬肝臟和腎臟金屬硫蛋白表達(dá)能力的影響，結(jié)果表明，不管是肝臟還是腎臟，MT的表達(dá)都取決于鋅的水平，雖然人們普遍認(rèn)為銅和鎘比鋅有更強(qiáng)的結(jié)合MT的能力，但是試驗(yàn)結(jié)果卻是在肝臟中隨著MT濃度的增高，MT結(jié)合銅和鎘的比例逐漸下降，也就是說MT結(jié)合銅和鎘的比例直接取決于鋅。故用金屬硫蛋白來評(píng)價(jià)豬體內(nèi)鋅營養(yǎng)水平是比較準(zhǔn)確的。筆者采用RT-PCR法（引物設(shè)計(jì)見表2）檢測(cè)了不同鋅源及鋅水平對(duì)豬肝臟金屬硫蛋白的影響(未發(fā)表)，發(fā)現(xiàn)80 mg/kg添加水平MT-mRNA相對(duì)表達(dá)豐度最高，與徐振華等在肉兔上的試驗(yàn)結(jié)果類似。

Vicki等研究了給年輕人補(bǔ)充鋅對(duì)單核細(xì)胞和紅細(xì)胞中金屬硫蛋白表達(dá)的影響（引物設(shè)計(jì)見表2），在18 d內(nèi)給年輕人每天補(bǔ)充50 mg的鋅，參照為空白對(duì)照，試驗(yàn)結(jié)果表明，在補(bǔ)充鋅8 d后，紅細(xì)胞中金屬硫蛋白含量顯著高于對(duì)照組，補(bǔ)充鋅2 d后單核細(xì)胞中金屬硫蛋白mRNA的水平顯著高于對(duì)照組，在18 d以后，不管是單核細(xì)胞還是紅細(xì)胞，加鋅組金屬硫蛋白的表達(dá)都相應(yīng)地提高。而加鋅組的血漿鋅含量在結(jié)束補(bǔ)鋅后的6 d內(nèi)仍比對(duì)照組高，直到22 d后，加鋅組血漿鋅水平才降到對(duì)照組的水平。此試驗(yàn)表明，單核細(xì)胞金屬硫蛋白mRNA和紅細(xì)胞內(nèi)金屬硫蛋白含量均能反映攝取鋅的水平，并且單核細(xì)胞金屬硫蛋白mRNA對(duì)鋅水平的反應(yīng)速度要比紅細(xì)胞金屬硫蛋白快。Sullivan等用競(jìng)爭(zhēng)性反轉(zhuǎn)錄PCR法測(cè)定了單核細(xì)胞內(nèi)MT-mRNA水平，指出單核細(xì)胞MT-mRNA評(píng)定Zn代謝狀況要比血漿Zn更有意義。

4 研究展望

動(dòng)物體內(nèi)適宜的鋅水平對(duì)生物體的生長發(fā)育、免疫、抗應(yīng)激及物質(zhì)代謝等多方面起著非常重要的作用，故給動(dòng)物日糧中補(bǔ)充鋅是非常有必要的，但是添加量的多少，則可以通過金屬硫蛋白的表達(dá)進(jìn)行評(píng)定，若通過組織鋅或者血漿鋅來評(píng)定鋅的添加量，則可能已經(jīng)超過動(dòng)物所需的量，并且反應(yīng)存在很大的遲緩。由于鋅誘導(dǎo)金屬硫蛋白的表達(dá)在不同動(dòng)物、不同組織中受到的影響存在差異，所以要更加準(zhǔn)確的用金屬硫蛋白來評(píng)定動(dòng)物體內(nèi)鋅的營養(yǎng)狀況，應(yīng)就不同動(dòng)物選取此動(dòng)物受影響最為敏感的組織作為試驗(yàn)材料。

（參考文獻(xiàn)29篇，刊略，需者可函索）