■胡艷平 王 磊 曹平華 胡雄兵 方明建 陳玉林

（西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100）

纖維素是地球上最豐富的可再生資源[1],而秸稈纖維素占有很大的比例。由于天然纖維素結構復雜和不易降解，對它的開發(fā)利用卻有限，造成了資源的很大浪費[2]；如何將這些秸稈纖維素轉(zhuǎn)化為可被畜禽利用的飼料成為我們研究的熱點，而尋找可有效分解秸稈纖維素的纖維素分解菌，并以此得到足量的纖維素分解酶是一個有效途徑[3]。纖維素酶既能有效地分解纖維素，又不會造成環(huán)境污染。自20世紀初Seillieve發(fā)現(xiàn)蝸牛消化液纖維素酶以來，纖維素酶的生物降解作用便成了關注的焦點[4]。關于微生物資源，研究得最多的是真菌，但其不足之處在于其菌劑難保存或難將其制成菌劑，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。近年來，陸續(xù)出現(xiàn)了芽孢細菌可有效降解纖維素的報道，產(chǎn)芽孢細菌因芽孢的形成，具有適應性強、作用底物廣泛及耐高溫的明顯優(yōu)勢[5]。提高纖維素酶的熱穩(wěn)定性可提高反應溫度，加快降解速度、節(jié)省反應時間，所以研究耐熱纖維素酶及其產(chǎn)生菌具有重要的實用價值，而秸稈纖維素的微生物降解是作為秸稈發(fā)酵飼料的最有前景的方法之一，產(chǎn)酶菌株直接作用于秸稈纖維素又是微生物降解中一項最基礎的研究工作，但這種研究目前并不多見。因此，本試驗從桑天牛排泄物中分離、篩選出產(chǎn)耐熱纖維素酶的芽孢桿菌，對其種屬進行鑒定，并研究其酶學特性和對麩皮、麥草秸稈、燕麥秸稈3種飼料粗纖維的降解效果，為該菌商業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶奠定基礎，并為秸稈纖維素的高效利用，解析其結構與功能的關系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

桑天牛幼蟲采自陜西省安康市桑種場桑樹種植基地，收集其排泄物保存于4℃冰箱中備用。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌E.coli DH5α購自北京天根生物公司，載體pGEM-T Easy Vector購自Promega公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）10 g、氯化鈉5 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水1 L，用緩沖液調(diào)至不同pH值，121℃高壓滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母抽提物5 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 L，pH值7.0，121℃高壓滅菌20 min。

基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）10 g、酵母抽提物5 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 L，pH值7.0，121℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：每50 ml種子培養(yǎng)基中各加入2.00 g麩皮、麥草秸稈、燕麥草粉，pH值7.0，121℃高壓滅菌20 min。

1.1.4 酶和試劑

基因組提取試劑盒購自北京百泰克公司，TA克隆試劑盒購自Promega公司，Taq酶及生化材料購自Takara公司；限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自Promega公司；NaCl、NaOH、H2SO4、葡萄糖、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、3，5-二硝基水楊酸、剛果紅、酚酞、甲基紅等購自西安沃爾森、楊凌三利化玻儀器公司；胰蛋白胨、酵母提取物購自OXOID公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離及篩選

稱取0.1 g桑天牛排泄物溶于1 ml滅菌水中，10倍稀釋后，取0.1 ml涂布于篩選培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取不同形態(tài)、長勢良好的菌株劃線分離純化。將各純化菌株梯度稀釋（10-1、10-3、10-5、10-7）后，取適量涂布于篩選CMC培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。選取適宜生長密度的CMC平板，1 mg/ml剛果紅溶液染色1 h,1 M的NaCl溶液脫色30 min，觀察透明圈大小，選擇H/C值（透明圈與菌落直徑大小之比）大的菌株進行后續(xù)研究。

1.2.2 纖維素酶活力測定

將篩選得到的菌株接種到基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)一定時間后，制備粗酶液，參照文獻[6]測定羧甲基纖維素酶(CMCase)酶活力，并稍作改進。在25 ml透明比色管中加入2 ml 1%的羧甲基纖維素鈉作為底物，預熱5 min，然后加入0.1 ml粗酶液，水浴5 min，迅速加入2.5 ml 3，5-二硝基水楊酸顯色液終止反應，煮沸5 min（另取1管作空白對照，即在25 ml的比色管中分別加入2 ml 1%的羧甲基纖維素鈉、2.5 ml 3，5-二硝基水楊酸溶液和0.1 ml經(jīng)煮沸30 min滅活的粗酶液，迅速混勻后沸水浴加熱5 min）；冷卻后，定容至10 ml，混勻；用空白管調(diào)零，于540 nm波長下測定OD值，根據(jù)葡萄糖標準曲線計算酶活力。將在上述條件下每分鐘由底物羧甲基纖維素分解產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的纖維素酶量定義為一個纖維素酶活力單位，用U/ml表示。

1.2.3 菌株種屬的鑒定

1.2.3.1 菌株的形態(tài)學鑒定

將篩選到的產(chǎn)纖維素酶菌株平板劃線，觀察其菌落形態(tài)，并經(jīng)革蘭氏染色后于顯微鏡下觀察。

1.2.3.2 菌株16S rDNA鑒定

以菌株的基因組DNA為模板，用16S rDNA通用引物(F∶5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'，R∶5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3')，擴增 16S rDNA 片段，克隆到pGEM-T Easy載體上，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，挑選陽性克隆，PCR和酶切鑒定后進行測序；陽性質(zhì)粒命名為pGEM-16S。

1.2.4 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1.2.4.1 培養(yǎng)時間對菌株HY3生長和產(chǎn)酶的影響

將菌株HY3種子液接種于(接種量為2%)50 ml基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)，于不同培養(yǎng)時間取樣測定OD595值和纖維素酶活性。

1.2.4.2 培養(yǎng)基初始pH值對菌株HY3生長和產(chǎn)酶的影響

將菌株HY3種子液分別接種（接種量為2%）到50 ml初始pH值為3、4、5、6、6.5、7、7.5、8、9、10、11的基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在1.2.4.1確定的適宜培養(yǎng)時間下，37℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)結束后測定OD595值和纖維素酶活性。

1.2.5 纖維素酶特性研究

產(chǎn)酶條件及初始培養(yǎng)基經(jīng)過優(yōu)化后，將種子培養(yǎng)液按2%的比例接種于基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于37℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)一定時間后，制備粗酶液。

1.2.5.1 酶促反應的最佳溫度及酶的熱穩(wěn)定性

將粗酶液與反應底物混合后，分別在30、40、50、60、65、70、75、80、90、100 ℃的溫度下反應，測定酶活力。酶的熱穩(wěn)定性的測定方法為將粗酶液分別在 30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100℃溫度下保溫1 h后，按常規(guī)方法于最佳反應溫度條件下測定酶活力，以未經(jīng)處理的粗酶液的酶活力100%計。

1.2.5.2 酶促反應的最佳pH值及酶的酸堿穩(wěn)定性

將粗酶液與底物組成的反應體系用緩沖液調(diào)至分別為3.5、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9、10的不同pH值，于最佳反應溫度條件下測定粗酶液的纖維素酶活力。酶的酸堿穩(wěn)定性的測定方法為將粗酶液于pH值為3.5、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9、10、11的緩沖液中37℃水浴保溫1 h，按常規(guī)方法于最適條件下測定酶活力，以未經(jīng)處理粗酶液的酶活力100%計。

1.2.6 菌株HY3對飼料粗纖維降解效果的研究

產(chǎn)酶條件及初始培養(yǎng)基經(jīng)過優(yōu)化后，將種子培養(yǎng)液按2%的比例分別接種到含有2.0 g麩皮、麥草秸稈和燕麥草粉的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，每種底物設置3個重復和1個未加菌液的空白對照，于37℃、220 r/min分別培養(yǎng)一定時間后，4℃、5 000 r/min離心10 min制備粗酶液。然后將殘渣全部轉(zhuǎn)入已恒重的300目尼龍袋中，恒重后用于測定粗纖維含量。原料和殘渣粗纖維含量用尼龍袋法[7]測定，并計算粗纖維降解率。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

用Excel進行數(shù)據(jù)整理，SPSS11.5進行統(tǒng)計分析，顯著水平為0.05。

2 結果

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選(見表1)

表1 纖維素酶產(chǎn)生菌篩選結果

經(jīng)過反復篩選，從桑天牛排泄物獲得6株H/C值較大的產(chǎn)纖維素酶的菌株，分別命名為HY1、HY2、HY3、HY4、HY5、HY6，其中菌株HY3的H/C值最大，為6.4。由表1可知，6株菌纖維素酶活力測定結果顯示：菌株HY3的酶活最高，為2.9 U/ml，因此選取菌株HY3作為進一步研究對象。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株HY3的形態(tài)學鑒定（見圖1）

圖1 革蘭氏染色結果

菌株HY3在LB平板上37℃培養(yǎng)12 h后，其菌落為橢圓形，邊緣不齊，菌落呈灰白色。革蘭氏染色后，菌體呈桿狀，兩端鈍圓，有芽孢，革蘭氏陽性。

2.2.2 菌株種屬鑒定（見圖2）

以菌株HY3的基因組DNA（圖2-A）為模板，用16S rDNA通用引物擴增獲得菌株的16S rDNA基因片段，大小約為1.5 kb（圖2-B）。質(zhì)粒pGEM-16S經(jīng)雙酶切后產(chǎn)生700 bp片段和800 bp片段（圖2-C），說明菌株HY3 16S rDNA被成功克隆和轉(zhuǎn)化。

通過同源性比對發(fā)現(xiàn)該菌株的16S rDNA序列與地衣芽孢桿菌屬（Bacillus licheniformis）細菌的16S rDNA序列同源性達到99%，再根據(jù)該細菌篩選時的菌落形態(tài)和革蘭氏染色結果，綜合分析確定該菌株為地衣芽孢桿菌屬，命名為Bacillus li?cheniformis HY3。

圖2 細菌基因組DNA、PCR產(chǎn)物和酶切電泳圖

2.3 菌株HY3產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.3.1 菌株HY3液體培養(yǎng)的生長曲線（見圖3）

圖3 菌株HY3生長曲線

由生長曲線可知，在4～24 h，曲線呈上升趨勢；24～30 h時達到最高峰，而30 h以后呈緩慢下降趨勢。所以確定菌株的對數(shù)生長期在8～24 h之間，因為對數(shù)生長期菌體活力旺盛，所以應選擇培養(yǎng)18 h種子液進行接種，最佳產(chǎn)酶時間為24 h。

2.3.2 菌體產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)時間（見圖4）

如圖4所示，纖維素酶活力隨著培養(yǎng)時間呈現(xiàn)先上升后下降的規(guī)律。纖維素酶活力在發(fā)酵8 h后大幅上升，至24 h時最高，為2.95 U/ml，隨后逐漸降低。該結果與菌體生長曲線（圖3）基本一致，因此確定菌株HY3產(chǎn)酶最佳培養(yǎng)時間為24 h。

圖4 培養(yǎng)時間對菌體產(chǎn)酶的影響

2.3.3 菌體生長及產(chǎn)酶的培養(yǎng)基最佳初始pH值（見圖5）

如圖5所示，菌株在pH值3.0～11的培養(yǎng)基中都能生長；在pH值3.0～6.5范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基初始pH值的升高，纖維素酶活力呈現(xiàn)上升趨勢，pH值為6.0～7.5時酶活力較高，最高值為2.99 U/ml；當pH值大于8時，其酶活力逐漸降低。表明該菌株在中性偏酸、偏堿（pH值6.0～8.0）環(huán)境中能很好地生長，并保持較高的產(chǎn)酶量，故確定菌株HY3生長、產(chǎn)酶的最適pH值為6.5～7。

圖5 培養(yǎng)基初始pH值對HY3菌株生長和產(chǎn)酶的影響

2.4 菌株HY3酶學性質(zhì)分析

2.4.1 酶反應的最適溫度（見圖6）

圖6 溫度對酶活力的影響

如圖6所示，在30～70℃范圍內(nèi)，酶活力隨溫度升高而上升，70℃最高，達到3.14 U/ml，在70～100℃范圍內(nèi)，酶活力隨溫度升高而迅速降低，由此說明該酶的最適反應溫度為70℃，該菌株產(chǎn)生的纖維素酶的最適反應溫度比報道的大多數(shù)細菌和真菌都要高。

2.4.2 酶的熱穩(wěn)定性（見圖7）

圖7 溫度對酶穩(wěn)定性的影響

如圖7所示，55℃以下酶的穩(wěn)定性較好，相對酶活力在80%以上，當溫度超過75℃時，相對酶活力隨著溫度的升高而迅速下降，但在90℃保溫1 h后仍有30%以上的活力，說明菌株HY3產(chǎn)生的纖維素酶耐熱性較好。

2.4.3 酶反應的最適pH值（見圖8）

圖8 pH值對酶活力的影響

如圖8所示，該菌株產(chǎn)生的纖維素酶在pH值5～9之間有較高的酶活力，pH值為6.5時酶活力最高，達到3.18 U/ml。說明菌株HY3產(chǎn)生的纖維素酶催化活性能適應較寬的pH值范圍。

2.4.4 酶反應的酸堿穩(wěn)定性（見圖9）

圖9 酶在不同pH值條件下的穩(wěn)定性

如圖9所示，粗酶液在pH值6～8范圍內(nèi)，相對酶活力可保持80%以上，pH值小于4.5和大于10時，該酶的穩(wěn)定性較差，說明菌株HY3產(chǎn)生的纖維素酶對強酸堿的耐受力較差，而在中性偏酸、偏堿條件下具有較好的穩(wěn)定性，適于液體發(fā)酵。

2.5 菌株HY3對飼料粗纖維降解效果

2.5.1 不同飼料對菌株HY3產(chǎn)酶的影響（見圖10）

將分別添加有麩皮、麥草秸稈和燕麥秸稈的發(fā)酵培養(yǎng)基，220 r/min、37℃搖瓶培養(yǎng)24 h后，制備粗酶液，按常規(guī)方法于70℃(反應pH值為6.5)測定酶活力。結果如圖10所示，該菌在添加麩皮的培養(yǎng)基中產(chǎn)纖維素酶的能力最強，達到5.01 U/ml，燕麥草粉次之，麥草秸稈培養(yǎng)基中檢測到酶活力最低，為3.66 U/ml。說明不同培養(yǎng)底物對菌株HY3的產(chǎn)酶影響比較大，這可能與底物的營養(yǎng)成分有關系。

2.5.2 粗纖維降解能力的分析（見表2）

如表2所示，隨培養(yǎng)時間的延長，麩皮、燕麥秸稈和麥草秸稈的粗纖維降解率無明顯變化(P＞0.05)。其中，麩皮的粗纖維降解率最高，最高為7.41%；麥草與燕麥秸稈的粗纖維降解率在4.89%～5.8%之間。菌株HY3對3種飼料粗纖維降解率的差異，與3種粗飼料作為不同底物對菌株HY3產(chǎn)酶的影響密切相關。麩皮為底物時，HY3的酶活最高，因此粗纖維的降解率最高，麥草秸稈為底物時，酶活最低，相應的降解率也是最低。

圖10 3種粗飼料對菌株HY3產(chǎn)酶的影響

表2 不同處理時間3種飼料粗纖維的降解率（%）

3 討論

3.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選與鑒定

纖維素酶廣泛存在于動植物體內(nèi)和微生物中；而天牛蛀食樹木，主要通過消化纖維素獲得養(yǎng)分[8]，其體內(nèi)纖維素酶一般有內(nèi)源性和外源性兩種。近些年來，從天牛腸道中篩選出了能產(chǎn)纖維素酶的細菌。曹月青等（2001）從桑粒肩天牛腸道中分離到1株纖維素分解菌[9]；劉晨娟等（2010）從桑粒肩天牛腸道中篩選到能降解纖維素的細菌，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌[10]。為從天牛體內(nèi)發(fā)掘新的降解纖維素的微生物，本試驗以桑天牛排泄物為材料，利用剛果紅染色產(chǎn)生透明圈的方法進行初篩，用DNS法測定發(fā)酵液酶活進行復篩，篩出1株產(chǎn)纖維素酶的菌株，并采用細菌形態(tài)學和分子生物學的方法對其種屬進行鑒定，該菌株為地衣芽孢桿菌屬。

3.2 不同發(fā)酵時間菌株HY3生長及產(chǎn)酶分析

本試驗結果顯示，隨著培養(yǎng)時間的增長，菌株的產(chǎn)酶活力呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在培養(yǎng)24 h時酶活力達到最大值。這可能與細菌所處不同生長階段有關，細菌在對數(shù)生長期（12～24 h）快速增殖，因而表現(xiàn)出酶活急劇上升；菌體生長進入穩(wěn)定期后，由于營養(yǎng)物質(zhì)逐漸耗盡，有害代謝產(chǎn)物不斷積累，導致細菌死亡速率大于增殖速率，從而導致菌株在培養(yǎng)36 h后產(chǎn)酶活力的顯著下降[11-12]。

3.3 酶耐熱特性研究

纖維素酶一般作為酶制劑添加到飼料中，由于飼料加工工程的特殊要求，適合于飼料中使用的酶必須具有好的熱穩(wěn)定性，因此對酶的耐熱性的研究非常必要[13-14]。李旺等（2012）對耐熱菌B.subtilis DR研究發(fā)現(xiàn)，其最適溫度為50℃[15]；而賀蕓（2006）發(fā)現(xiàn)，嗜熱脂肪芽孢桿菌的最適溫度為66℃[16]。本試驗中，通過分析菌株HY3產(chǎn)生的纖維素酶性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，該酶最適反應溫度為70℃；在75℃下保溫1 h，其相對酶活力為65%，在90℃保溫1 h后仍有30%左右的活力，表明該菌分泌的纖維素酶具有較高的耐熱性，顯示出更大的應用潛力。

3.4 菌株HY3對不同粗飼料降解率效果的分析

本試驗中，添加麩皮和燕麥秸稈的培養(yǎng)基中菌株產(chǎn)酶活力較麥草的高，這可能與麩皮和燕麥秸稈所含的營養(yǎng)成分較豐富有關，其所含蛋白質(zhì)分別為14%和19.42%，具有十分豐富的植物蛋白質(zhì)資源[17]，可為菌株提供豐富的碳源和氮源。另外，3種飼料的粗纖維降解率隨培養(yǎng)時間的增長無明顯差異，但麩皮的粗纖維降解率最高，最高可達7.41%，麩皮與燕麥秸稈在纖維素降解率所表現(xiàn)出的差異，可能與其纖維素含量有關，麩皮粗纖維含量較低，僅10%左右，從而表現(xiàn)出較高的粗纖維降解率。而麥草表現(xiàn)出的酶活力和降解率較低，可能與其細胞壁結構較致密、纖維素含量較高有關。

3.5 尼龍袋法測定粗纖維降解率的分析

目前，測定粗纖維的方法有很多，如近紅外漫反射光譜測定法、濾袋分析法、二次萃取快速測定法等。這些方法都能方便、簡單、快速地測定飼料中粗纖維的含量，但由于這些方法大多需特定的儀器，價格昂貴，很難在所有的實驗室中普及應用。比較而言，使用尼龍袋法測定粗纖維，既能減少殘渣轉(zhuǎn)移的次數(shù)，縮短試驗時間，又可以保持傳統(tǒng)方法的準確度。吳秋玨等(2005)[7]對傳統(tǒng)方法與尼龍袋法的測定結果進行比較，認為選用260目尼龍布測定粗纖維降解率時，其結果與傳統(tǒng)方法差異不大。但本試驗中選用300目尼龍布的測定時，發(fā)現(xiàn)仍有少量損失。因此，用尼龍袋法測定粗纖維時，針對不同粗飼料（如麩皮、麥草秸稈和燕麥秸稈）選用適宜目數(shù)的尼龍袋尚需進一步研究。

4 結論

①本試驗通過剛果紅染色初篩和測定粗酶液酶活力復篩，從桑天牛排泄物中篩選到一株能夠分解纖維素的細菌，經(jīng)形態(tài)學和細菌16S rDNA鑒定，該細菌為地衣芽孢桿菌屬，命名為Bacillus licheniformis HY3。

②菌株HY3的適宜生長和產(chǎn)酶pH值為6.5～7，生長和產(chǎn)酶最佳培養(yǎng)時間為24 h。該菌產(chǎn)生的纖維素酶的最適反應溫度為70℃，75℃保溫1 h后仍有65%以上活力，在90℃保溫1 h仍有30%左右的活力，顯著高于報道水平，屬于耐熱性纖維素酶；在pH值6.5時酶活最高，而且在較寬的pH值范圍內(nèi)都具有較高的反應活性，但對強酸堿的耐受力較差，在中性條件下具有較好的穩(wěn)定性。

③菌株HY3在添加麩皮的培養(yǎng)基中纖維素酶活性(5.01 U/ml)和對粗纖維的降解率(7.41%)均最高；在添加麥草的培養(yǎng)基中酶活性和對粗纖維的降解率均最差；飼料粗纖維的降解率隨時間的變化不大。