■ 王哲奇 齊景偉 安曉萍 陳大勇 仝寶生

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古斯隆生物技術(shù)有限責任公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 011517）

大豆多肽是以大豆蛋白質(zhì)為原料，經(jīng)酸、堿或酶的水解作用后而得到的由不同氨基酸組成的多肽鏈的通稱[1]。通過酶降解大豆蛋白，能使大豆蛋白中的抗原成分大大減少，用酶免疫測定法研究發(fā)現(xiàn)，與大豆蛋白質(zhì)相比，大豆肽的抗原性僅為大豆蛋白質(zhì)的1/100～1/1 000[2]。已有實驗發(fā)現(xiàn)大部分蛋白質(zhì)在多肽形態(tài)時就能被吸收，且動物體內(nèi)大部分蛋白質(zhì)也是以多肽形式直接吸收的。因此，大豆多肽在腸道的吸收率最好，且其消化吸收性比蛋白質(zhì)更佳[3]。采用固態(tài)發(fā)酵制備大豆多肽飼料，具有培養(yǎng)基簡單、投資少、能耗低、技術(shù)較簡單、產(chǎn)物的產(chǎn)率較高、含水量低、發(fā)酵后產(chǎn)品處理方便等多個優(yōu)點，并且固態(tài)發(fā)酵法可以實現(xiàn)更大規(guī)模生產(chǎn)，豆粕飼料產(chǎn)量更大，能有效運用在豆粕飼料加工業(yè)中[4]。

李善仁等[5]采用響應(yīng)面分析法對枯草芽孢桿菌和米曲霉混合發(fā)酵豆粕產(chǎn)大豆肽的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)基條件為料水比為1∶1.149，MgSO4濃度為0.048%，糖蜜濃度為0.294%，在此條件下，優(yōu)化后的大豆肽含量為21.74%。吳寶昌[6]以肽轉(zhuǎn)化率和蛋白酶酶活為指標確定最佳發(fā)酵工藝條件，確定枯草芽孢桿菌1389與米曲霉3.042混合發(fā)酵制備豆粕飼料的最佳發(fā)酵條件：接種時間差6 h，發(fā)酵溫度30℃，培養(yǎng)基含水量64%，菌種混合比例1∶1，發(fā)酵時間72 h。在此條件下測得發(fā)酵豆粕的蛋白酶酶活值在980 U/g左右，大豆肽轉(zhuǎn)化率在50%左右。

本試驗在優(yōu)化好的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進一步對發(fā)酵條件進行優(yōu)化。發(fā)酵底物豆粕中添加麩皮7.5%、腐殖酸鈉2%、糖蜜0.2%、磷酸氫二鉀1%、硫酸鎂0.2%。分別采用Plackett-Burman方法分析發(fā)酵時間、加水量、接種量、發(fā)酵溫度、初始pH值、裝料量6種因素對產(chǎn)生多肽含量的影響，確定裝料量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度為影響多肽的重要因素。然后采用響應(yīng)面法對篩選出的3個對多肽的產(chǎn)量有顯著影響的因素再進一步優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 原料

豆粕：市購，麩皮：市購，腐植酸鈉：從褐煤中提取，純度為42%，由內(nèi)蒙古永業(yè)集團有限公司提供。

1.2 菌種

枯草芽孢桿菌CGMCC1.0895、米曲霉CGMCC 2.0951，購買于中國微生物菌種保藏中心。

1.3 培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌斜面培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/l、氯化鈉5 g/l、蛋白胨10 g/l、pH值7.0，瓊脂20 g/l。

米曲霉斜面培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。

枯草芽孢桿菌液體種子培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/l、氯化鈉5 g/l、蛋白胨10 g/l，pH值7.0。

米曲霉液體種子培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基。

1.4 種子液的制備

枯草芽孢桿菌經(jīng)斜面活化后刮取一環(huán)接入其液體培養(yǎng)基中，35℃，120 r/min培養(yǎng)24 h；米曲霉接種到斜面培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng)72～96 h，用無菌生理鹽水洗去斜面培養(yǎng)基上的孢子，調(diào)整孢子數(shù)達到108，最后按枯草芽孢桿菌菌液與米曲霉孢子懸液2∶1的比例混合作為發(fā)酵用種子液。接種量按2.5%接入滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.5 發(fā)酵底物

發(fā)酵底物：糖蜜0.2%、腐殖酸鈉2%、磷酸氫二鉀0.7%、麩皮7.5%，250 ml三角瓶中豆粕裝量按需要分為10、20、30 g。

1.6 PB實驗設(shè)計

對發(fā)酵時間、加水量、接種量、發(fā)酵溫度、初始pH值、裝料量6個因素進行全面考察，選用N=12的Plackett-Burman設(shè)計，每個因素分別?。?，-1）高低兩水平，各因素及水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素水平

1.7 響應(yīng)面試驗

根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，對Plackett-Burman設(shè)計中篩選出裝料量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度三個重要影響因素設(shè)計三因素三水平共15個實驗點的響應(yīng)面分析實驗，其中12個是析因點，3個零點重復[7]。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計各因素水平

1.8 多肽含量的測定

烘干的豆粕研磨過60目篩，準確稱取2.000 g，加蒸餾水溶解并定容至100 ml，取10 ml并加入等體積15%三氯乙酸溶液，靜止5 min后，4 000 r/min離心，取上清液。凱氏定氮法測定發(fā)酵產(chǎn)物中酸溶性蛋白的含量[8]。茚三酮顯色法測定發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸的含量[9]。多肽含量為酸溶性蛋白與游離氨基酸之差[8]。

1.9 數(shù)據(jù)處理

本試驗采用Minitab 16分析軟件設(shè)計試驗及對試驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 Plackett-Burman設(shè)計結(jié)果

對6個因素進行全面考察，選用N=12的Plackett-Burman設(shè)計，利用Minitab 16軟件對多肽含量進行回歸分析，結(jié)果見表3和表4。由回歸分析可知，發(fā)酵時間對多肽含量的影響極顯著(P=0.006)，其次是發(fā)酵溫度對多肽含量影響顯著(P=0.072)，裝料量對多肽含量影響也較顯著(P=0.088)，而接種量、加水量，初始pH值對多肽含量的影響均不顯著（P＞0.1）。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果

表4 Plackett-Burman試驗方差分析結(jié)果

2.2 響應(yīng)面結(jié)果

選用裝料量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度為自變量，發(fā)酵產(chǎn)物中的多肽含量為響應(yīng)值，試驗結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果

回歸分析試驗數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計分析軟件Minitab 16進行二次回歸分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型為：

其中復相關(guān)系數(shù)的平方R2=88.12%，說明這種試驗方法是比較可靠的。對回歸方程進行方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果見表6。

根據(jù)上述擬合回歸方程作響應(yīng)面分析圖，結(jié)果見圖1、圖2、圖3。

表6 二次回歸方差分析

圖1 裝料量-發(fā)酵時間響應(yīng)面分析(發(fā)酵溫度30℃)

圖2 裝料量-發(fā)酵溫度響應(yīng)面分析(發(fā)酵時間84 h)

圖3 發(fā)酵時間-發(fā)酵溫度響應(yīng)面分析(裝料量20 g)

圖1顯示的是發(fā)酵溫度30℃時，裝料量(X1)與發(fā)酵時間(X2)對大豆多肽含量的交互影響效應(yīng)，在本實驗水平范圍內(nèi)，隨裝料量(X1)減少，大豆多肽含量是增加的；隨發(fā)酵時間（X2）的增長，大豆多肽含量也是增加的。圖2顯示的是發(fā)酵時間84 h時，裝料量(X1)與發(fā)酵溫度(X3)對大豆多肽含量的交互影響效應(yīng)，在本試驗水平范圍內(nèi)，隨裝料量(X1)減少，大豆多肽含量是增加的；隨發(fā)酵溫度（X3）的升高，大豆多肽也含量是增加的。圖3顯示的是裝料量20 g時，發(fā)酵時間(X2)與發(fā)酵溫度(X3)對大豆多肽含量的交互影響效應(yīng)，在本試驗水平范圍內(nèi)，隨發(fā)酵時間（X2）的增長，大豆多肽含量增加；隨發(fā)酵溫度(X3)的升高，大豆多肽含量增加。

最終由Minitab 16分析軟件中響應(yīng)優(yōu)化器得到：X1=-1；X2=1；X3=1時，即裝料量10 g；發(fā)酵時間96 h；發(fā)酵溫度34℃。此時大豆肽含量的理論值可達21.97%。

3 討論

本文通過二水平設(shè)計的Plackett-Burman實驗分析了6種因素對米曲霉和枯草芽孢桿菌混合固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)多肽量的影響，選擇出影響顯著的裝料量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度這三個影響因素根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理建立了主要因素影響多肽產(chǎn)量的二次響應(yīng)面回歸模型。并利用統(tǒng)計學的方法對該模型進行顯著性檢驗，優(yōu)化各因素水平，探討了它們之間的交互作用。在最佳發(fā)酵條件：裝料量10 g；發(fā)酵時間96 h；發(fā)酵溫度34℃。多肽含量的理論值可達21.97%，實際試驗中驗證得到多肽含量為21.32%，與理論值相差不大。由此可見采用響應(yīng)面分析法對米曲霉和枯草芽孢桿菌混合固態(tài)發(fā)酵豆粕發(fā)酵條件進行優(yōu)化是比較有效的。該研究結(jié)果為枯草芽孢桿菌和米曲霉固體發(fā)酵工藝開發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)和參考價值，但由于優(yōu)化所得的最優(yōu)點均在邊緣水平，所以還需擴大范圍再進一步優(yōu)化。

4 結(jié)論

枯草芽孢桿菌和米曲霉固態(tài)發(fā)酵豆粕制備多肽飼料的條件為裝料量10 g，發(fā)酵時間96 h，發(fā)酵溫度34℃時效果最好，多肽含量能達到21.32%。