■ 王 雄程宗佳王彥斐王 麗王 江

（1.北京中檢維康技術(shù)有限公司，北京 100044；2.中糧營養(yǎng)健康研究院動(dòng)物營養(yǎng)與飼料中心，北京 100020）

嘔吐毒素又稱為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，屬單端孢霉烯族化合物。1973年Yoshizawa首先分離得到了這種化合物，并命名為4-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，同年Vesonder等從污染鐮刀菌并導(dǎo)致美國母豬拒食和嘔吐的玉米中分離得到同樣的化合物，將其命名為嘔吐毒素。嘔吐毒素主要由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產(chǎn)生，容易對豬產(chǎn)生毒性，對人產(chǎn)生食物中毒性白細(xì)胞缺乏癥。動(dòng)物飼料中嘔吐毒素的中毒癥狀表現(xiàn)為：厭食、嘔吐、消化道發(fā)炎、白血球下降、白尿、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、內(nèi)臟出血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞變質(zhì)，具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，對血液及皮膚組織具有損害作用，細(xì)胞生長上表現(xiàn)出抑制蛋白質(zhì)合成和DNA合成的作用[1]。歐盟規(guī)定豬飼料中的嘔吐毒素不得超過0.5 mg/kg,美國的規(guī)定是不得超過1 mg/kg，中國標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定豬、犢牛和泌乳期動(dòng)物配合飼料中嘔吐毒素不得超過1 mg/kg[2]，中國農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定玉米干全酒糟（DDGS）中嘔吐毒素也是不得超過1 mg/kg[3]。我國飼料及飼料原料中嘔吐毒素污染非常嚴(yán)重[4-10]，最高值為32.9 mg/kg，為了保護(hù)動(dòng)物健康和食品安全，需要加強(qiáng)對飼料產(chǎn)品中嘔吐毒素的檢測與控制。

目前測定嘔吐毒素常用的檢測方法有薄層色譜法[11]、酶聯(lián)免疫法[12]和親和柱凈化-高效液相色譜法[13]。但這些分析方法需要大型的儀器設(shè)備、操作過程復(fù)雜、時(shí)間長，無法在現(xiàn)場和基礎(chǔ)中小型實(shí)驗(yàn)室使用。近年來膠體金免疫層析技術(shù)在真菌毒素快速檢測中得到應(yīng)用[14-15]，但主要以定性檢測為主[15-17]，存在顯色模糊，人為判斷有誤差，假陽性假陰性比例高等問題。本文建立并驗(yàn)證了膠體金免疫層析法快速定量檢測飼料中嘔吐毒素的分析方法。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試劑和材料

除注明外,試劑均為分析純,試驗(yàn)用水均為超純水。

iCheck嘔吐毒素定量快檢卡（CS105，美國CLOVER）由包被有金標(biāo)記嘔吐毒素抗體的微孔、噴涂有嘔吐毒素抗原檢測線、鼠二抗控制線的測試卡和稀釋緩沖液組成。稀釋緩沖溶液：CSB-2，美國CLOVER。乙腈：色譜純，美國JT BAKER公司。1.5 μm玻璃纖維濾紙：英國WHATMAN公司。嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液：200 μg/ml，美國SUPLCO公司。嘔吐毒素免疫親和柱：IAC111，美國CLOVER公司。飼料樣品：玉米、玉米酒糟、麥麩、豬飼料、雞飼料。

1.2 儀器與設(shè)備

iCheck食品安全定量快檢儀：Ⅱ型，美國CLOVER；通過對檢測線和控制線的顏色分析而進(jìn)行定量檢測。高效液相色譜儀配紫外檢測器：型號(hào)L-10A，為島津公司產(chǎn)品。

液相色譜工作條件：①色譜分析柱：Cloversil ODS-C18柱,5 μm,4.6×250 mm；②流動(dòng)相：乙腈+水(10+90，V/V)；③流速：0.8 ml/min；④進(jìn)樣量：20 μl；⑤柱溫:25℃；⑥紫外檢測波長：218 nm。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的提取

取50～250 g樣品粉碎，過20目篩，稱取5.0 g磨細(xì)樣品加入到50 ml離心管中，再添加25 ml純水，用多功能旋轉(zhuǎn)混合器混合5 min(或者人工用手劇烈振蕩3 min，或用高速均質(zhì)器均質(zhì)1～2 min)，用中速定性濾紙過濾，收集全部濾液。

1.3.2 免疫層析法快速定量檢測

取濾液120 μl于抗體微孔中，加入30 μl稀釋緩沖液，用移液器吸打8次混勻，取100 μl加入到快檢卡樣品孔中。37℃溫育10 min后，將快檢卡插入定量快檢儀中讀數(shù)，即為樣品實(shí)際濃度。該方法的定量檢測限為500 μg/kg，檢測范圍為0～5 000 μg/kg。讀數(shù)值為500 μg/kg時(shí)，說明測定結(jié)果等于或大于500 μg/kg，如果需要進(jìn)一步獲得定量的檢測結(jié)果，需要將樣品提取濾液用純水按一定比例稀釋，然后進(jìn)行檢測，稀釋倍數(shù)乘以儀器讀數(shù)即為檢測結(jié)果。

1.3.3 免疫親和柱凈化-HPLC法檢測

粗過濾濾液用玻璃纖維濾紙?jiān)龠^濾，移取濾液2.0 ml過CLOVER嘔吐毒素免疫親和柱，調(diào)節(jié)流速約1～2滴/s，直至空氣完全通過免疫親和柱。分別用5 ml的純水以約2～3滴/s清洗免疫親和柱2次，直至空氣完全通過免疫親和柱。加入1.0 ml甲醇，調(diào)節(jié)流速約1～2滴/s的流速將免疫親和柱中的嘔吐毒素淋洗下來，用氮?dú)鈱⑾疵撘捍蹈?，加?.3 ml流動(dòng)相，混勻后20 μl注入液相色譜分析。

2 結(jié)果和討論

2.1 免疫層析快速定量法準(zhǔn)確性和重復(fù)性的試驗(yàn)結(jié)果

在空白樣品中分別添加嘔吐毒素為500、1 000、5 000 μg/kg濃度水平，然后按照免疫層析法快速定量檢測（見1.3.2），其檢測結(jié)果見表1。

表1 免疫層析快速定量法準(zhǔn)確性和重復(fù)性的試驗(yàn)結(jié)果

從表1中回收率及精密度數(shù)據(jù)可以看出，本方法嘔吐毒素回收率為75.7%～96.1%之間，室內(nèi)3個(gè)水平添加5次重復(fù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在19.5%以內(nèi)。

2.2 免疫層析快速定量法檢出限和定量限的測定

取玉米、玉米酒糟、麥麩、豬飼料、雞飼料5類樣品用免疫親和柱凈化-HPLC法測定不含有嘔吐毒素的空白樣品各10份，用免疫層析法快速定量檢測，結(jié)果見表2。我們定義空白樣品測定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差SD為方法檢出限(LOD)，測定平均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差SD為方法定量限(LOQ)。

通過對5類共50個(gè)空白樣品中嘔吐毒素的檢測，可以確定免疫層析快速定量法測定嘔吐毒素的檢出限為200 μg/kg，定量限為500 μg/kg。

2.3 與免疫親和柱凈化-HPLC方法的對比試驗(yàn)結(jié)果

10個(gè)陽性樣品，應(yīng)用免疫親和柱凈化-HPLC法和免疫層析快速定量法分別進(jìn)行檢測（見1.3），其測定結(jié)果見表3。

表2 免疫層析快速定量法測定空白樣品的試驗(yàn)結(jié)果(μg/kg)

表3 陽性樣品的試驗(yàn)結(jié)果

表3中相對偏差的計(jì)算是以免疫親和柱凈化-HPLC法測定值為參考值，免疫層析法測定結(jié)果的最大相對偏差為17.3%，兩組測定結(jié)果之間的相關(guān)系數(shù)為0.98，說明其相關(guān)性顯著。

3 結(jié)論

膠體金免疫層析快速定量法測定飼料及飼料原料中的嘔吐毒素，方法的檢出限為200 μg/kg，定量限為500 μg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于19.5%，回收率為75.7%～96.1%，其準(zhǔn)確性和可靠性均可以滿足歐盟[18]和中國[19]對嘔吐毒素分析方法標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求：回收率70%～110%，CV小于20%。分析一個(gè)樣品的時(shí)間為20 min內(nèi)，與免疫親和柱凈化-HPLC法的相關(guān)性好。該方法簡便快速、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可用于對飼料及飼料原料中嘔吐毒素進(jìn)行快速定量篩查檢測。