■馮 平 張鐵鷹 王德山 鄒林源劉俊麗 何宏媛

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，飼料資源短缺問題愈顯突出，糧油和食品加工副產(chǎn)品被越來越多地應(yīng)用于豬日糧配方中。若能夠提高這些飼料原料中纖維在豬后腸內(nèi)的降解效率，充分挖掘其潛在消化能值，對改善當(dāng)前豬生產(chǎn)性能和節(jié)約飼料資源具有重要意義。豬作為一種雜食性單胃動物，其消化道中并不分泌分解纖維素的酶，但其后腸中存在著大量的纖維降解菌[1-3]，豬日糧中的纖維類物質(zhì)可在后腸通過微生物的發(fā)酵作用最終生成短鏈脂肪酸（SCFA）為其供能[4]。但目前關(guān)于豬后腸參與纖維降解的微生物種類及其對纖維降解的代謝過程以及不同微生物之間的相互作用尚不清楚。而要對豬后腸的纖維分解菌做系統(tǒng)的研究，除借助分子生物學(xué)手段外，傳統(tǒng)的纖維分解菌厭氧分離培養(yǎng)也是必不可少的。一方面，獲得純培養(yǎng)微生物后可通過對這些微生物生長代謝特性更好地去認(rèn)識豬后腸的微生態(tài)環(huán)境，并與整體研究相互補充，揭示豬后腸的纖維發(fā)酵過程，為豬后腸的纖維發(fā)酵調(diào)控，提高豬對纖維的利用效率提供更多的理論依據(jù)；另一方面，分離獲得豬后腸的纖維分解菌株對開發(fā)利用新的微生物資源以及新型酶制劑的開發(fā)也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取初始體重在（80±2.5）kg的長白×大白二元雜交去勢公豬12頭，隨機(jī)分為3個處理組，每個處理4個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。每個處理組試驗豬分別飼喂麩皮、大豆皮和玉米皮高纖維半純合日糧，在第49 d進(jìn)行屠宰取樣，剖開腹腔后，迅速雙線結(jié)扎豬的盲腸盲端、結(jié)腸中部以及直腸中部，將相應(yīng)腸段剪下后分別裝入6號自封袋中，放入38℃預(yù)熱保溫箱中迅速帶回實驗室進(jìn)行下一步實驗。

1.2 試劑溶液

細(xì)菌基因組提取試劑盒購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司；2×Taq Master Mix購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；DL 2000 DNA Maker購自TaKaRa公司；木聚糖（櫸木，X4252；樺木，X0502），刃天青（resazurin）購自Sigma公司；革蘭氏染液購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；API 20A厭氧菌鑒定系統(tǒng)（BioM-erieux，ref 20300）購自北京威泰科生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

無細(xì)胞瘤胃液：采自成年荷斯坦奶牛瘤胃，經(jīng)四層紗布過濾，5 000 r/min條件下離心20 min，以初步去除瘤胃液中的雜質(zhì)；隨后10 000 r/min條件下離心30 min，以去除瘤胃液中的細(xì)胞。將上清液置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 培養(yǎng)基[5]

常量礦物質(zhì)溶液4：K2HPO43.0 g定容至1 000 ml。

常量礦物質(zhì)溶液5：KH2PO43.0 g、(NH4)2SO46.0 g、NaCl 6.0 g、MgSO4·7H2O 0.6 g、CaCl2·2H2O 0.2 g定容至1 000 ml。

Pfenning微量礦物質(zhì)溶液：H3BO3300 mg、Zn-SO4·7H2O 100 mg、MnCl2·4H2O 30 mg、CoCl·6H2O 20 mg、Na2MoO4·2H2O 30 mg、Na2SeO310 mg、Ni-Cl220 mg、CuCl2·2H2O 10 mg、FeCl2·4H2O 150 mg先溶于100 ml 0.25 mol/l鹽酸溶液中，后用蒸餾水定容至1 000 ml.

揮發(fā)性脂肪酸混合液（VFA mix）：17 ml乙酸，6 ml丙酸，4 ml正丁酸，正戊酸、異戊酸、異丁酸、2-甲基丁酸各1 ml混合均勻，密封保存于4～8℃。

氯化高鐵血紅素（Haemin）溶液：將50 mg氯化血紅素用1 N NaOH溶解后用蒸餾水定容至100 ml。

木聚糖液體富集培養(yǎng)基：木聚糖7 g，常量礦物質(zhì)溶液4、5液各150 ml，Pfenning微量礦物質(zhì)溶液 1 ml，無細(xì)胞瘤胃液 300 ml，Tryptone 0.5 g，Yeast extract 0.5 g，揮發(fā)性脂肪酸混合液3.1 ml，NaHCO38 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.1 g，0.1%刃天青1 ml，定容至1 000 ml，通CO2氣體120 min至培養(yǎng)基無色，調(diào)pH值至7.0，在厭氧培養(yǎng)箱中將上述培養(yǎng)基分裝于已通氣除氧的厭氧管中，每管10 ml，每管繼續(xù)通CO2氣體5 min，121℃滅菌30 min。

木聚糖固體選擇培養(yǎng)基：在上述木聚糖液體富集培養(yǎng)基中加入16～20 g瓊脂即可。

麩皮、大豆皮、玉米皮或木聚糖生長產(chǎn)酶培養(yǎng)基：在每個厭氧管中準(zhǔn)確稱取(0.0700±0.0020)g麩皮、大豆皮、玉米皮（過80目篩）或木聚糖底物，通氣除氧，隨后將按上述方法配制的液體培養(yǎng)基分裝于上述厭氧管中，每管10 ml，每管繼續(xù)通CO2氣體5 min，121 ℃滅菌 30 min。

1.4 菌株的分離、鑒定

1.4.1 木聚糖降解菌的富集分離

將結(jié)扎的腸段樣品帶回實驗室后，每個日糧組各頭豬各個腸段的樣品各取2 g左右放入37℃預(yù)熱的180 ml厭氧稀釋液中制成接種液，取該接種液進(jìn)行10-1～10-4梯度稀釋后接種到木聚糖液體富集培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)。當(dāng)富集培養(yǎng)液中能夠檢測到顯著的木聚糖酶活性時對其進(jìn)行梯度稀釋后接種厭氧滾管中，38℃培養(yǎng)直至菌落長出。挑取單菌落進(jìn)行分離純化4～5次至菌落形態(tài)一致。

1.4.2 木聚糖降解菌的鑒定

按照沈萍等[6]的方法取菌液進(jìn)行革蘭氏染色，細(xì)菌生化鑒定采用API 20A厭氧菌生化鑒定系統(tǒng)。利用細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，運用細(xì)菌16S rDNA通用引物：F27：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和R1492：5’-GGTTACCTTG TTACGACTT-3’擴(kuò)增16S rDNA序列。反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 12.5 μl，菌液 1 μl，上下游引物（10 μmol/ml）各 0.5 μl，剩余體積用ddH2O補齊。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送交北京博邁德科技有限公司測定。測序結(jié)果在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對分析，利用MEGA 5.1進(jìn)行多序列比對，并采用Neighbour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap（重復(fù)數(shù)為1 000）檢驗分子系統(tǒng)樹拓?fù)浣Y(jié)果的穩(wěn)定性。

1.5 篩選菌在四種不同底物中的生長和產(chǎn)酶特性

將純化的菌株按5%的接種量分別接種于麩皮、大豆皮、玉米皮或木聚糖生長產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，38 ℃恒溫培養(yǎng)，監(jiān)測培養(yǎng) 24、36、48、60、72、84、96、108 h時菌株生長曲線和產(chǎn)酶曲線。生長曲線測定時首先將各發(fā)酵液在1 000 r/min離心2 min后用分光光度計測定OD600值，木聚糖酶和纖維素酶測定方法參考董杰麗[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

從木聚糖培養(yǎng)基中分離純化出一株木聚糖降解能力較強(qiáng)的菌M9，該菌株培養(yǎng)基中的形態(tài)為圓形淡黃色菌落，菌落顏色由中間向四周逐漸變白，多生長于培養(yǎng)基內(nèi)部，表面的菌落相對較少。雖然該菌在生長過程中不能觀察到明顯的透明水解圈，但在木聚糖滾管中培養(yǎng)一周左右即可使整個滾管中不透明的樺木木聚糖培養(yǎng)基變透明，表明該株細(xì)菌具有較強(qiáng)的木聚糖分解能力(見圖1)，選擇該菌進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖1 分離獲得的木聚糖分解菌菌株M9及沒接菌的對照滾管

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 細(xì)菌革蘭氏染色

菌株M9為革蘭氏陽性桿菌，在不產(chǎn)生芽孢時，菌株M9為長桿菌，單個或短鏈狀排列（圖2a）；當(dāng)產(chǎn)生芽孢時，菌體一端膨大呈梭狀（圖2b）。

圖2 菌株M9兩種不同形態(tài)革蘭氏染色圖片

2.2.2 API 20A厭氧菌鑒定系統(tǒng)鑒定

API 20A厭氧菌鑒定系統(tǒng)顯示該菌能利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、柳醇、木糖、阿拉伯糖、纖維二糖、甘露糖、松叁糖、棉籽糖、鼠李糖等眾多底物，能水解明膠但不能生成吲哚、不能產(chǎn)生脲酶、接觸酶陰性。菌株M9的API 20A生化鑒定系統(tǒng)鑒定所得數(shù)值為46776313，登陸apiweb查厭氧菌數(shù)值編碼檢索表顯示M9與梭狀梭菌(Clostridium clostridiiforme)的親緣關(guān)系最近，為93.8%（P=0.65）。

表1 菌株API 20A生化鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果

圖3 菌株M9基因組和16S rDNA電泳圖

2.2.2 篩選菌16S rDNA鑒定(見圖3)

由圖3可見提取的菌株M9基因組DNA大小在23 kb左右，以其為模板，利用16S rDNA通用引物F27和R1492進(jìn)行PCR擴(kuò)增得其16S rDNA序列，片段長度約為1 460 bp。

將測序得到的菌株M9 16S rDNA序列在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行BLAST比對分析，選擇親緣關(guān)系近的標(biāo)準(zhǔn)菌株序列在MEGA中進(jìn)行比對，采用Neighbour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。M9與Zhang等從漳州市造紙廠廢水中分離得到的梭菌屬細(xì)菌Clostridium sp.strain S6的相似性極高，可達(dá)99%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明該株菌與柔嫩梭菌（Clostridium leptum DSM 753T）和球孢梭菌（Clostridium sporosphaeroides DSM 1294）的親緣關(guān)系較近，相似性在93%左右；與瘤胃球菌屬白色瘤胃球菌（Rumincoccus albus ATCC 27211）、布氏瘤胃球菌（Ruminococcus bromii ATCC 27255）相似性也比較高，可達(dá)90%左右。與已報道具有纖維降解能力的其它梭菌屬細(xì)菌如熱纖梭菌（Clostridium thermocellum JCM 9323）和Clostridium herbivorans親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4 菌株M9的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 篩選菌在四種不同底物中的生長和產(chǎn)酶特性

菌株M9在樺木木聚糖、麩皮、大豆皮和玉米皮四種底物中的生長曲線和產(chǎn)酶曲線見圖5和圖6。

圖5 菌株M9在四種不同底物中的生長曲線

由圖5可知，菌株M9在木聚糖和麩皮底物中的生長速度要快于在大豆皮和玉米皮底物中的生長速度。菌株M9在四種底物中產(chǎn)木聚糖酶曲線與其生長曲線隨時間變化規(guī)律基本一致：木聚糖酶活性在培養(yǎng)24～96 h內(nèi)增加不明顯，但從96～108 h出現(xiàn)顯著的增加趨勢，且木聚糖底物中的木聚糖酶活性要顯著高于其它幾種底物，麩皮底物中木聚糖酶活性也較高。

圖6 菌株M9在四種不同底物中產(chǎn)木聚糖酶曲線

3 討論

在哺乳動物的消化道尤其是瘤胃和后腸中定植著大量的微生物是日糧纖維降解的主要場所。纖維素和半纖維素是地球上儲量最為豐富的可再生資源，但由于其難降解特性及抗?fàn)I養(yǎng)特性使其在動物日糧配方尤其是單胃動物日糧配方中的應(yīng)用受到限制。隨我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，飼料資源短缺問題愈顯突出，如何提高豬等單胃動物對纖維的利用效率已顯得尤為重要。

而目前對豬后腸纖維分解菌的研究相對較少，豬后腸已分離得到的嚴(yán)格厭氧纖維降解菌主要有溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）[8]，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌（F.succinogenes）和黃色瘤胃球菌（R.flavefaciens）[1]，棲瘤胃普雷沃氏菌（Prevotella ruminicola）[3]和梭菌屬細(xì)菌 Clostridium longisporum[9]。由于豬的后腸屬于嚴(yán)格厭氧的環(huán)境，因而定植在豬后腸中的大多數(shù)細(xì)菌都應(yīng)該屬于嚴(yán)格厭氧菌及少數(shù)兼性厭氧菌。故在對豬后腸的纖維分解菌進(jìn)行分離時采用嚴(yán)格厭氧的分離培養(yǎng)方法是可行的。亨氏滾管法是一種較為基礎(chǔ)的厭氧分離方法，最早由Hungate提出并運用于瘤胃微生物的研究[10-11]，這種厭氧技術(shù)的培養(yǎng)基中包含了礦物質(zhì)、碳酸-碳酸氫鹽緩沖液、無菌瘤胃液和瓊脂，獲得厭氧條件的的方法是用CO2或其他合適的氣體置換掉試管中的氣體。本試驗采用的厭氧培養(yǎng)技術(shù)參考Mcsweeney[6]所描述的方法，這與Robert等[12]對人糞樣中纖維素分解菌的分離以及Chassard等[13]對人糞樣中的木聚糖分解菌進(jìn)行分離時所采用的培養(yǎng)基配方和厭氧操作技術(shù)十分相似，說明單胃動物后腸微生物的分離可參考反芻動物瘤胃厭氧菌的分離方法。

本研究利用亨氏滾管法從長白×大白二元雜交豬后腸食糜中分離獲得一株木聚糖降解細(xì)菌M9。經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察、培養(yǎng)特性研究、生化鑒定及16S rDNA序列分析，可鑒定M9為梭菌屬細(xì)菌。在進(jìn)行16S rDNA序列分析時，BLAST比對結(jié)果顯示M9的16S rDNA序列與已培養(yǎng)的細(xì)菌序列中梭菌屬細(xì)菌Clostridium sp.strain S6的相似性是最高的，可達(dá)99%，查詢該豬細(xì)菌的序列提交信息可知菌株Clostridium sp.strain S6為Zhang等從漳州市造紙廠廢水中分離得到的梭菌屬細(xì)菌，但并未鑒定到種，而且也查閱不到相關(guān)的文獻(xiàn)報道。BLAST結(jié)果還表明M9的16S rDNA序列與其它已鑒定的細(xì)菌的相似性都較低，與柔嫩梭菌（Clostridium leptum DSM 753T）的相似性僅有93%，與球孢梭菌(Clostridium sporosphaeroides DSM 1294)的相似性僅有91%，分析菌株M9很有可能是梭菌屬的一個新種。此外，在本研究中還采用了API 20A厭氧菌生化鑒定系統(tǒng)對M9進(jìn)行生化鑒定。API 20A系統(tǒng)是由法國梅里埃公司研發(fā)的一系列微生物鑒定系統(tǒng)，具有快速、標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點，在醫(yī)學(xué)微生物鑒定中有廣泛應(yīng)用且其鑒定結(jié)果為國際所認(rèn)可。API 20A厭氧菌生化鑒定系統(tǒng)對M9的鑒定結(jié)果顯示M9與梭狀梭菌(Clostridium clostridiiforme)的親緣關(guān)系最近，為93.8%（P=0.65），但將M9的16S rDNA序列與Clostridium clostridioforme strain ATCC 25537 16S rDNA序列比對相似性僅有74%，推斷M9并非梭狀梭菌(Clostridium clostridiiforme)，但可以肯定M9為梭菌屬細(xì)菌，進(jìn)一步推斷M9極有可能是梭菌屬的一個新種，且其生化鑒定反應(yīng)特性與梭狀梭菌(Clostridium clostridiiforme)的相似性較高。

菌株M9在木聚糖底物中的生長速度和產(chǎn)木聚糖酶活性均要明顯高于麩皮、大豆皮和玉米皮底物，而麩皮底物中的細(xì)菌生長速度和產(chǎn)木聚糖酶活性又稍高于大豆皮和玉米皮底物。這極有可能是底物的組成成分不同和結(jié)構(gòu)差異造成的。M9為木聚糖降解菌，故在純木聚糖培養(yǎng)基中能夠直接利用底物迅速生長，而且培養(yǎng)基中的木聚糖可能對木聚糖酶具有誘導(dǎo)作用，故在純木聚糖培養(yǎng)基中木聚糖酶活性較高。且木質(zhì)素對木聚糖酶的產(chǎn)生有抑制作用[14]，麩皮、大豆皮和玉米皮雖也都含有木聚糖，但其木聚糖與其他的纖維成分如纖維素和木質(zhì)素交聯(lián)在一起，阻礙了細(xì)菌對木聚糖的利用，故細(xì)菌的生物量和所產(chǎn)木聚糖酶活性都受到抑制。朱崇淼[15]研究發(fā)現(xiàn)從黑白花公牛糞樣中分離獲得的厭氧真菌A4在分別以稻草秸、玉米秸、花生秸和濾紙作為底物時，以稻草秸為底物時A4菌產(chǎn)生的木聚糖酶活力和比活力最高，分析主要是由于稻草秸的半纖維素含量最高，而花生秸的木質(zhì)素含量最高造成的，與本研究的結(jié)果相一致。而董杰麗在研究分離自成年母豬后腸的兼性厭氧細(xì)菌MZ和ZF時發(fā)現(xiàn)其在木聚糖和混合飼草2種碳源培養(yǎng)基中也表現(xiàn)出不同的生長和產(chǎn)酶活性，但是與本研究不同的是這兩株細(xì)菌在以混合飼草為底物時的生長高峰和產(chǎn)酶高峰均先于木聚糖底物，且在混合飼草發(fā)酵培養(yǎng)基中所產(chǎn)木聚糖酶活性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于木聚糖培養(yǎng)基。這很有可能是分離菌的特性不同造成的。

4 結(jié)語

本試驗采用嚴(yán)格厭氧的方式對豬后腸的纖維分解菌進(jìn)行分離，并最終獲得了一株分解木聚糖能力較強(qiáng)的菌株M9，經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察、培養(yǎng)特性研究、生化鑒定及16S rDNA序列分析，可鑒定M9為梭菌屬細(xì)菌，且為豬后腸首次發(fā)現(xiàn)一株新的厭氧木聚糖分解菌。