■李 鵬劉敏躍龍 淼郭 洋 王 哲 何劍斌 劉國文

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866；2.遼寧省農(nóng)牧業(yè)機(jī)械研究所有限公司，遼寧沈陽 110036；3.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長春 130062)

圍產(chǎn)期奶牛干物質(zhì)攝入減少，能量需求增加，機(jī)體處于能量負(fù)平衡狀態(tài)，從而使這一時(shí)期成為酮病等營養(yǎng)代謝性疾病的高發(fā)期。能量負(fù)平衡勢必會促進(jìn)機(jī)體脂肪動員，導(dǎo)致大量游離脂肪酸（NEFA）進(jìn)入血液并最終進(jìn)入肝臟代謝。當(dāng)進(jìn)入肝臟的NEFA超過肝臟本身氧化代謝速率時(shí)，大量NEFA就會發(fā)生不完全氧化而生成酮體或再酯化合成甘油三酯，從而引發(fā)酮病或脂肪肝[4]。酮體主要包括β-羥丁酸（BHBA）、丙酮、乙酰乙酸，其中BHBA大約占70%。

肝臟是BHBA合成的主要器官，3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A合成酶（HMGCS）是BHBA合成過程中的關(guān)鍵限速酶。BHBA作為機(jī)體主要的中間代謝產(chǎn)物，酮病時(shí)其在奶牛血液中的濃度發(fā)生顯著改變。但有關(guān)高水平BHBA對脂肪酸在肝臟氧化代謝過程尤其是BHBA自身合成的影響則鮮有報(bào)道。本研究采取新生犢牛肝細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，檢測外源性BHBA對HMGCS基因表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步探討B(tài)HBA對奶牛肝臟脂肪酸氧化代謝途徑的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

瓊脂糖、Tris、蛋白胨、酵母提取物、Taq DNA聚合酶、RNAisoTMPlus、DNA Marker DL 2000、pMD18-T Simple Vector，TaKaRa公司產(chǎn)品；小劑量快速質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，杭州維特杰公司產(chǎn)品；SYBR GreenⅠ熒光定量PCR試劑盒，杭州博日公司產(chǎn)品；焦磷酸二乙酯（DEPC）、HEPES、BHBA，Sigma公司產(chǎn)品；Bovine 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase ELISA kit，CUSABIO公司產(chǎn)品；RPMI-1640，Gibco公司產(chǎn)品；氯仿、異丙醇、乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 犢牛原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

采用張才等改良的膠原酶兩步灌流法分離培養(yǎng)犢牛肝細(xì)胞。

1.3 肝細(xì)胞的分組與處理

培養(yǎng)72 h后，選擇生長狀態(tài)良好的肝細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，分為空白對照組與BHBA試驗(yàn)組，BHBA組分別添加含有不同濃度的 BHBA（0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mM）的細(xì)胞培養(yǎng)液，每個(gè)處理孔設(shè)3個(gè)重復(fù)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后分別提取各孔細(xì)胞的總RNA和總蛋白，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 HMGCS mRNA表達(dá)水平檢測

表1 試驗(yàn)用PCR引物序列

采用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法對HMGCS基因進(jìn)行定量。首先根據(jù)GenBank中登錄的 HMGCS mRNA（NM_001045883）和β-actin（NM_173979）序列及引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer Express 2.0軟件設(shè)計(jì)引物，具體引物序列見表1。按常規(guī)方法進(jìn)行目的基因的克隆、連接、轉(zhuǎn)化和鑒定，獲得陽性定量模板克隆質(zhì)粒，將陽性質(zhì)粒分別稀釋至 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，根據(jù)8個(gè)濃度的值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法分析基因的相對表達(dá)差異，以最大限度減少試驗(yàn)誤差，計(jì)算結(jié)果及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用F值表示，計(jì)算公式如下：

1.5 HMGCS蛋白表達(dá)水平檢測

采用ELISA法，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加 200 μl細(xì)胞裂解液，作用 3～5 min，再轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，每隔5～6 min輕柔振蕩1次，共4次，4℃，1 000 r/min離心3 min，取上清，-80℃保存?zhèn)溆谩２捎肂radford方法定量檢測裂解液總蛋白濃度，整個(gè)裂解過程在冰上操作。采用Bovine 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase ELISA kit(cat.no.CSB-E12140B)，測定肝細(xì)胞HMGCS蛋白濃度。采用相對定量方法計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平變化，按下式計(jì)算，計(jì)算結(jié)果及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Q值表示。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)全部選用SPSS 13.0進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)。結(jié)果采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”方式表示,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

如圖1所示，隨著培養(yǎng)液中BHBA濃度逐漸升高，HMGCS mRNA和蛋白表達(dá)水平逐漸降低。與對照組相比（0 mM），低濃度BHBA（≤1.0 mM）對HMGCS mRNA和蛋白表達(dá)未產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05），但當(dāng)培養(yǎng)液中BHBA濃度達(dá)到1.5 mM時(shí)，HMGCS mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），且隨著BHBA濃度不斷增加該抑制作用持續(xù)增強(qiáng)，呈劑量依賴性。

圖1 不同濃度BHBA對肝細(xì)胞HMGCS基因表達(dá)的影響

3 討論

BHBA是脂肪酸在肝臟發(fā)生不完全氧化所生成的特殊中間產(chǎn)物，血漿BHBA濃度反映了NEFA在肝中進(jìn)行氧化代謝的能力。正常情況下，肝臟中產(chǎn)生的少量酮體可以作為能量底物供給肝外組織使用，如骨、心肌和腎皮質(zhì)等。當(dāng)奶牛肝臟中NEFA不完全氧化產(chǎn)生BHBA的水平超過肝外組織利用BHBA的能力時(shí)，大量BHBA就會在血漿、肝臟和外周組織中蓄積，從而引發(fā)酮病。目前，國際上普遍將血清BHBA水平作為奶牛酮病的診斷指標(biāo)。

關(guān)于BHBA對肝臟脂肪酸氧化代謝的具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。有研究表明，高濃度BHBA能夠顯著抑制犢牛肝細(xì)胞肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(CPTⅠ)、脂酰輔酶A合成酶（ACSL）、檸檬酸合成酶（CS）和乙酰輔酶A羧化酶（ACC）等基因表達(dá)，抑制肝臟脂肪酸氧化和合成代謝過程，導(dǎo)致肝脂代謝紊亂。但有關(guān)BHBA對其自身合成的調(diào)控作用尚未見報(bào)道。HMGCS是控制BHBA合成的關(guān)鍵限速酶，其表達(dá)受禁食、運(yùn)動、日糧成分等多種因素調(diào)控。Hegardt研究表明，饑餓可以增加HMGCS mRNA和蛋白表達(dá)水平，從而導(dǎo)致動物體內(nèi)BHBA含量升高。本人前期研究結(jié)果表明，盡管酮病奶牛血清BHBA水平升高，但肝臟中HMGCS mRNA和蛋白水平仍顯著低于健康奶牛，且奶牛血清BHBA濃度與肝組織中HMGCS蛋白水平呈顯著負(fù)相關(guān)，提示HMGCS表達(dá)降低可能與高濃度的BHBA有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，高濃度BHBA（≥1.5 mM）可以顯著抑制肝細(xì)胞HMGCS mRNA和蛋白表達(dá)，呈劑量依賴性。表明高濃度的BHBA可能對HMGCS具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，通過降低HMGCS基因的表達(dá)而減少肝臟中BHBA的合成，進(jìn)一步證實(shí)了上述研究結(jié)果。

（參考文獻(xiàn)12篇，刊略，需者可函索）