■美合熱阿依·木臺(tái)力甫 樊 振 買(mǎi)爾哈巴·艾合買(mǎi)提 烏斯?jié)M·依米提

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830046）

青貯飼料是在密閉缺氧的條件下，通過(guò)厭氧乳酸菌的發(fā)酵作用，抑制各種雜菌的繁殖而得到的一種粗飼料。青貯飼料氣味酸香、柔軟多汁、適口性好、營(yíng)養(yǎng)豐富、利于長(zhǎng)期保存，是家畜優(yōu)良飼料來(lái)源。因此乳酸菌是高品質(zhì)青貯飼料生產(chǎn)中的主要微生物之一。

目前，國(guó)內(nèi)外在飼料乳酸菌提高飼料發(fā)酵品質(zhì)等方面進(jìn)行了大量研究并取得了一定的效果。但是，由于秸稈細(xì)胞壁的纖維素成分含量較高，限制了該類(lèi)飼料消化率的提高。為了解決該問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外主要研究方法就是將纖維素酶制劑添加到青貯飼料中。但纖維素酶制備復(fù)雜，投資成本也相對(duì)較高。因此，纖維素分解菌作為添加劑是降低投資成本的有效方法。但是，對(duì)于乳酸菌與纖維素分解菌作為混合添加劑應(yīng)用于改善青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的研究在國(guó)內(nèi)目前是個(gè)新領(lǐng)域，在國(guó)外的研究也很少。

測(cè)定高效乳酸菌和纖維素分解菌混合培養(yǎng)有無(wú)相互抑制作用是本研究的主要目的。在本研究中主要應(yīng)用嚴(yán)萍（2011）從青貯玉米中分離得到的高效乳酸菌與本科研組人員從瘤胃中分離得到的纖維素分解菌混合培養(yǎng)，以判定兩者是否會(huì)相互抑制生長(zhǎng)，從而對(duì)研發(fā)混合添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用本研究室分離得到的4株菌株，分別是高效乳酸菌A4、A7和纖維分解菌Nf、Y6。

MRS培養(yǎng)基：用于乳酸菌A4、A7的活化培養(yǎng)。

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：用于纖維素分解菌Nf、Y6的活化培養(yǎng)。

2%糖水：為了讓試驗(yàn)結(jié)果更接近實(shí)地青貯試驗(yàn)，采用2%糖水培養(yǎng)混合菌株。

儀器設(shè)備：分光光度計(jì)、滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 試驗(yàn)流程

已分離得到的凍存菌株→初次活化→二次活化→測(cè)活菌數(shù)→按比例混合加入到2%糖水中→每4 h測(cè)OD值→達(dá)到穩(wěn)定期測(cè)活菌數(shù)→畫(huà)出生長(zhǎng)曲線→結(jié)果分析。

1.2.2 試驗(yàn)所用菌株準(zhǔn)備

將分離后凍存的乳酸菌和纖維素分解菌各取出0.4 ml分別加入到10 ml MRS液體培養(yǎng)基和羧甲基纖維素鈉液體培養(yǎng)基中,在35℃培養(yǎng)，纖維素分解菌培養(yǎng)28 h再次活化。乳酸菌培養(yǎng)18～20 h再次活化，并且第二次活化時(shí)間為16 h。

1.2.3 活菌數(shù)測(cè)定

在混合培養(yǎng)之前和混合培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)都要進(jìn)行活菌數(shù)測(cè)定。穩(wěn)定期測(cè)活菌數(shù)是將混合培養(yǎng)液分別用MRS和羧甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，由于纖維素分解菌可在MRS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而乳酸菌不能在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)（已在試驗(yàn)中得到），由此可分別測(cè)出兩者活菌數(shù)。

活菌數(shù)測(cè)定：吸取0.5 ml待測(cè)菌液用滅菌的生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)x擇適當(dāng)?shù)南♂屘荻?，吸?00 μl菌懸液置于平板內(nèi)，加入15 ml左右的MRS培養(yǎng)基混勻，每個(gè)稀釋梯度3個(gè)平行。平板在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，選擇菌落數(shù)在30～300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 混合培養(yǎng)及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將兩種菌培養(yǎng)液按表1中比例進(jìn)行混合加入到2%蔗糖溶液中,35℃培養(yǎng)48 h,以空白2%蔗糖溶液為對(duì)照,每4 h測(cè)定樣品的吸光值OD600,以時(shí)間為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制混合菌的生長(zhǎng)曲線。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

試驗(yàn)所得的混合菌OD值生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 混合菌生長(zhǎng)曲線

圖2 混合菌生長(zhǎng)曲線

在圖1中可看出,除了對(duì)照組所有試驗(yàn)組都在4 h進(jìn)入生長(zhǎng)期，單獨(dú)混合乳酸菌和纖維素分解菌，其達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間較長(zhǎng)，在4個(gè)試驗(yàn)組中第一組A4∶Nf 28 h率先達(dá)到穩(wěn)定期，且生長(zhǎng)情況較好。

由圖2可知，5組試驗(yàn)組達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間都比單獨(dú)混合菌短，都在16～20 h之間，其中[（A4+A7）∶（Nf+Y6）]的穩(wěn)定期時(shí)間為16 h。

2.2 活菌數(shù)測(cè)定

混合培養(yǎng)前不同菌株培養(yǎng)液中活菌數(shù)見(jiàn)表2。

表2 原培養(yǎng)液中的活菌數(shù)

混合培養(yǎng)后活菌數(shù)見(jiàn)圖3。在圖3中可看出，乳酸菌活菌數(shù)在 A4∶Nf、A7∶Y6、A4∶Y6、（A4+A7）∶（Nf+Y6）試驗(yàn)組中都較高，而纖維素分解菌在A4∶Nf、A7∶Y6、（A4+A7)∶（Nf+Y6)試驗(yàn)組中較高。兩者均高的有A4∶Nf和（A4+A7）∶（Nf+Y6）試驗(yàn)組，其中（A4+A7）∶（Nf+Y6）試驗(yàn)組的最好。

圖3 各個(gè)試驗(yàn)組活菌總數(shù)

3 結(jié)論與討論

①根據(jù)阿布都克尤木·麥麥提(2012)、買(mǎi)爾哈巴·艾合買(mǎi)提等(2013)研究結(jié)果可知，本試驗(yàn)所用乳酸菌達(dá)到穩(wěn)定期約在16 h左右，纖維素分解菌則在28 h左右才會(huì)達(dá)到穩(wěn)定期。而在本試驗(yàn)研究中試驗(yàn)組(A4+A7)∶(Nf+Y6)穩(wěn)定期時(shí)間段為16 h，說(shuō)明4種菌株全混合添加時(shí)可促進(jìn)彼此生長(zhǎng)。

②由試驗(yàn)所得到的生長(zhǎng)曲線和活菌數(shù)可看出，各個(gè)試驗(yàn)組達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)活菌數(shù)都有增長(zhǎng)，而且其中（A4+A7）∶（Nf+Y6）組的生長(zhǎng)情況最好，可初步確定本研究所用到的乳酸菌和纖維素分解菌并不相互抑制彼此生長(zhǎng)。

③最近研究的青貯飼料生物添加劑主要包括乳酸菌接種劑和纖維素酶制劑。本研究初步得出，乳酸菌和纖維素分解菌并不互相抑制，為研發(fā)出纖維素分解菌代替纖維素酶與乳酸菌混合作為添加劑提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)，并且進(jìn)一步制定出高品質(zhì)飼料制作模式提供了基礎(chǔ)。