■商婷婷 張日俊

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料生物技術(shù)實驗室動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193）

抗生素濫用導(dǎo)致藥物殘留及耐藥性菌株的產(chǎn)生，致使人類與動物健康存在隱患。乳酸菌作為食品級的生物防腐劑生產(chǎn)菌株有著無毒、無殘留等優(yōu)點[1]。因此，開發(fā)利用乳酸菌及其代謝產(chǎn)物作為新型安全有效的綠色飼料添加劑和天然食品防腐劑成為研究熱點?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可產(chǎn)生多種細菌素，如Nisin，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌具有抑菌活性，包括李斯特氏菌、腸球菌、葡萄球菌、鏈球菌、微球菌、分枝桿菌、棒桿菌和乳桿菌等[2]；此外，乳酸乳球菌(L.lactis)的2個亞種：乳酸亞種(ssp.lactis)和乳脂亞種(ssp.cremoris)在乳酪制作的產(chǎn)香和產(chǎn)黏過程中具有重要的作用，可為凝乳形成和風(fēng)味產(chǎn)生提供最佳的條件[3]。該研究采用傳統(tǒng)方法與分子生物技術(shù)相結(jié)合，成功分離鑒定了4株乳酸乳球菌和2株魏斯氏菌，旨在為篩選高產(chǎn)且具有高效抑制病原微生物作用的細菌素及改善食品風(fēng)味的物質(zhì)的乳酸菌奠定基礎(chǔ)，為其在畜牧業(yè)與食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

篩選樣品：生牛奶（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)）、自制泡菜水、青貯料（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)）、市售某品牌奶酪；培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基、添加0.01%溴甲酚紫的MRS瓊脂培養(yǎng)基；試劑：藥品均為國產(chǎn)分析純，細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）、渦旋振蕩器（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）、電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、恒溫培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）、冰箱（Haier）、人工氣候箱（廣東省醫(yī)療器械廠）、電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、WD-9413A凝膠成像分析儀（北京市六一儀器廠）、pH計（美國DEN?VER）；YT-IMS-45全自動雪花制冰機（北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司）、電泳儀（北京市六一儀器廠）、溫度梯度PCR儀（美國BIO-RAD）、超凈臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離及菌落形態(tài)觀察

將樣品進行梯度稀釋，采用平板涂布法，取100 μl適宜濃度的樣品稀釋液涂勻于含溴甲酚紫的MRS培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)36 h，觀測并記錄菌落形態(tài)特征。

1.3.2 乳酸球菌的純化及細胞形態(tài)觀察

挑取使添加0.01%溴甲酚紫的MRS培養(yǎng)基變黃的單菌落，采用平板劃線分離法，在MRS培養(yǎng)基上反復(fù)純化。挑取生長48 h的單菌落進行涂片、革蘭氏染色、鏡檢，觀察菌體形態(tài)顏色是否一致。

1.3.3 乳酸球菌菌種的保藏

挑取長勢較好的單菌落，分別接種于MRS斜面培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，于37℃過夜培養(yǎng)，取出，斜面培養(yǎng)菌種置于4℃冰箱儲存，備用。培養(yǎng)液與濃度為60%的甘油等量混合，分裝，-20℃保存。

1.3.4 乳酸球菌的生理生化鑒定

通過接觸酶試驗、甲基紅試驗、V-P試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、淀粉水解試驗等試驗對菌株是否屬于乳酸球菌進行鑒定；通過糖發(fā)酵試驗、菌株在4%NaCl、6.5%NaCl下是否生長，菌株在溫度為10、40、45℃下是否生長的試驗，初步進行了乳酸球菌種間鑒定[4]。

1.3.5 乳酸球菌的16S rDNA序列測定

根據(jù)細菌基因組提取試劑盒所示操作步驟，提取目標(biāo)菌株的基因組DNA。PCR擴增：采用通用引物，正向引物為27f：5'-AGAGTTTGATCCTG?GCTCAG-3'，反向引物為1525r：5'-AGAAAGGAG?GTGATCCAGCC-3'；反應(yīng)體系 40 μl：DNA 模板6 μl；上游引物 1 μl；下游引物 1 μl；ddH2O 12 μl；2×Taq PCR MasterMix 20 μl；擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸1.5 min；30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物的核酸序列由上海英俊公司測定，測序結(jié)果與Gen?Bank中的已知株序列進行比對，并以ST7為例，利用Clustalx2.0和MEGA5.10構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離及菌落特征

含0.01%溴甲酚紫的MRS培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色，表明有大量酸產(chǎn)生，培養(yǎng)基中為乳酸球菌疑似菌。挑取單菌落，將其純化，培養(yǎng)36 h，菌落特征如表1。

表1 乳酸球菌在MRS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征

2.2 乳酸球菌的純化及鏡檢細胞特征

鏡檢下，棄掉桿菌，共得9株乳酸球菌，均為革蘭氏陽性，不運動，無芽孢、無鞭毛、無莢膜，球形、卵圓形或一端鈍圓、一端較小的類球形，單個、成對或短鏈。乳酸菌細胞形態(tài)特征如圖1。

圖1 乳酸菌在顯微鏡下的細胞形態(tài)特征

2.3 乳酸球菌的生理生化特征（見表2）

9株菌株在生化試驗中，均符合乳酸球菌的鑒別特征，在45℃下均不能生長，可以判定非腸球菌及鏈球菌[4-5]，其中ST2、ST3、ST4、ST5及ST9不耐4%NaCl，且在40℃下不生長，可以初步判定為乳酸乳球菌乳脂亞種。

表2 乳酸球菌的生理生化特征

2.4 乳酸球菌的16S rDNA序列分析(見表3及圖2)

由表3可知，ST1、ST9與乳酸乳球菌的相似性為99%，將其鑒定為乳酸乳球菌；ST2、ST3、ST4及ST5經(jīng)序列比對為同一菌株，與乳酸乳球菌乳脂亞種的相似性為99%，將其鑒定為乳酸乳球菌乳脂亞種；ST7與乳酸乳球菌乳酸亞種的相似性為100%，將其鑒定為乳酸乳球菌乳酸亞種；ST6與食竇魏斯氏菌的相似性為99%，判定其為食竇魏斯氏菌；ST8與魏斯氏菌的相似性為100%，判定其為魏斯氏菌。

表3 乳酸球菌分離菌株的16S rDNA序列分析

以ST7為例，繪制發(fā)育樹如圖2，更直觀地表明ST7為乳酸乳球菌乳酸亞種。

3 討論

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹

試驗中，菌落為乳黃色或暗黃色，而文獻中的乳酸菌菌落多為乳白色[3]，豐富了乳酸菌的鑒定依據(jù)。在青貯料和市售某品牌奶酪中未篩到乳酸乳球菌，原因可能是試驗所用青貯料為焙干的青貯料，在焙干過程中，殺死了乳酸菌；市售奶酪在制作過程中，殺死了乳酸乳球菌。乳酸菌素可以改善腸道微生態(tài)平衡，提高機體免疫力，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收[6]，使其在作為飼料添加劑及食品保鮮防腐方面具有巨大潛力?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的乳酸菌細菌素有40余種，但廣泛應(yīng)用的只有乳酸鏈球菌素（Nisin）[7]。本試驗表明，生牛奶是乳酸乳球菌的優(yōu)良生境，為進一步篩選高產(chǎn)細菌素、類細菌素的菌種奠定了基礎(chǔ)，此外，也為選擇優(yōu)良的產(chǎn)黏菌種、提高乳品綜合質(zhì)量提供可能。

Collins MD等提出了魏斯氏菌屬（Weissella）的名稱[8]，本試驗指出，泡菜水是魏斯氏菌的優(yōu)良生活環(huán)境，培養(yǎng)基中添加了溴甲酚紫指示劑，更便于鑒別菌株的產(chǎn)酸能力，篩得的魏斯氏菌產(chǎn)酸速度快、耐酸能力強，可能是泡菜發(fā)酵的優(yōu)勢菌種，研究其產(chǎn)酸、產(chǎn)細菌素能力對飼料添加劑行業(yè)發(fā)展具有重要意義。

傳統(tǒng)鑒定方法在篩選及純化微生物方面具有重要作用，但是對菌株鑒定不夠精確，分子生物技術(shù)鑒定菌株重現(xiàn)性強、速度快、可靠性高，將二者有機結(jié)合，則更好地完成菌種鑒定。

4 結(jié)論

通過菌落形態(tài)特征觀察、鏡檢細胞形態(tài)特征觀察、生理生化鑒定、16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，本試驗分別于生牛奶和泡菜水中分離鑒定了4株乳酸乳球菌和2株魏斯氏菌，為進一步研究其生物學(xué)特性及產(chǎn)細菌素能力奠定基礎(chǔ)，為其在飼料工業(yè)及食品工業(yè)中的應(yīng)用研究提供依據(jù)。