■ 周邦維 李 勇 郭培紅 于學權 常欣堂 高婷婷 柳 陽

（1.中國科學院海洋研究所，山東青島 266071；2.山東貝瑞康生物科技有限公司，山東濰坊 261061；3.天津市海發(fā)珍品實業(yè)發(fā)展有限公司，天津 300452；4.海洋生態(tài)養(yǎng)殖技術國家地方聯(lián)合工程實驗室，山東青島 266071）

卵黃抗體作為飼料添加劑其發(fā)展迅速，給仔豬、雛雞、蟹、蝦等養(yǎng)殖動物飼喂卵黃抗體，可增加腸絨毛的高度和隱窩深度，并能降低空腸球狀細胞和淋巴濾泡的數(shù)目[1]；日增重和免疫保護率顯著提高，死亡率顯著降低[2-3]。本試驗采用的抗腸炎功能蛋白是具有抗腸炎效果的卵黃抗體添加劑，其作為一種全新的綠色抗病促長添加劑，以靶器官明確、效果顯著、耐高溫不易被消化酶分解等特點，已在一些水產(chǎn)養(yǎng)殖動物腸道健康、促生長和提高飼料利用方面取得可喜進展。但對我國正在興起、前景廣闊的現(xiàn)代封閉循環(huán)水工廠化養(yǎng)殖海珍魚類的生理效應和添加技術未進行專門試驗，也未見有研究參考報道。

點帶石斑魚（Epinephelus coioides）為輻鰭魚綱鱸形目鱸亞目鮨科石斑魚屬的魚類，俗稱青石斑，性情兇猛，屬肉食性魚類，其肉質(zhì)肥美鮮嫩、營養(yǎng)豐富。石斑魚市場價格不菲，是經(jīng)濟價值較高的海水養(yǎng)殖魚類。目前雖然對點帶石斑魚的蛋白質(zhì)等主要營養(yǎng)成分的研究已經(jīng)比較深入[4-7]，但關于抗腸炎功能蛋白作為配合飼料添加劑用于改善石斑魚的生長、消化、水質(zhì)等研究鮮有報道。

本試驗研究采用新穎的生態(tài)營養(yǎng)學原理和方法，在現(xiàn)代封閉循環(huán)海水工廠化養(yǎng)殖條件下，對抗腸炎功能蛋白新產(chǎn)品在膨化顆粒飼料中添加后對石斑魚生長、消化、水質(zhì)的作用進行探尋，獲得適宜添加量，為“抗腸炎功能蛋白”的推廣應用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗設計

采用單因素隨機試驗設計，設置4個試驗處理：分別在基礎飼糧中添加0‰、1‰、2‰、3‰的抗腸炎功能蛋白添加劑，形成0#、1#、2#、3#飼糧，即4個不同日糧處理組，每處理4個重復，共計16個試驗單元，每單元養(yǎng)殖40條點帶石斑魚幼魚，試魚共計640尾。在工業(yè)化封閉循環(huán)海水養(yǎng)殖條件下，進行115 d試驗（正試期105 d，預試期10 d）。

1.2 試驗飼料

基礎飼料組成及營養(yǎng)成分見表1。試驗基礎配合飼料的原料，經(jīng)超微粉碎等處理后達到80目細度，按設計比例混合均勻，在瑞士布勒公司制造的BCTGD62型水產(chǎn)飼料專用雙螺桿擠壓膨化機上，制成粒徑為5 mm的半沉性膨化顆粒飼料，再經(jīng)烘干、冷卻、打包后待用。

表1 基礎飼料組成及主要營養(yǎng)成分（%）

抗腸炎功能蛋白添加劑由山東貝瑞康生物科技有限公司提供。在每次飼喂試魚前3～5 d，將蛋白粉按試驗設計比例配成水溶液后，人工拌到基礎飼料表面，形成各組試驗料，室內(nèi)晾干待用。

1.3 試驗用魚及飼養(yǎng)管理

試驗在天津海發(fā)珍品實業(yè)發(fā)展有限公司進行，試驗用魚來自公司二車間，從來源和批次相同的魚池中挑選健康、無畸形、體重相近[（64.80±0.56）g]的點帶石斑魚幼魚640尾，隨機分配到16個養(yǎng)殖桶（水高0.6 m，桶徑1 m）里，每桶40尾魚。所有養(yǎng)殖桶的進水都經(jīng)同一封閉循環(huán)水系統(tǒng)過濾、消毒、增氧等處理，水溫維持在27～29℃。每天7:40和16:30飽食飼喂兩次，記錄攝食量及死淘魚數(shù)量等情況。養(yǎng)殖試驗過程中根據(jù)試魚攝食情況，及時調(diào)整投餌量。試驗共進行115 d，結束時停食24 h，使用MS222麻醉石斑魚后進行稱重及解剖取樣。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 生長指標及測定方法

增重率(WGR,%)=100×(W2-W1)/W1；

特定生長率(SGR,%/d)=100×(lnW2-lnW1)/t；

攝食量(FR,%)=100×C/[(W2+W1)/2]；

飼料系數(shù)(FCE)=C/(W2-W1)。

式中：W1——試驗開始時每尾魚的平均濕重（g）；

W2——試驗結束時每尾魚的平均濕重（g）；

C——每尾試驗魚的平均總攝食量(風干重，g);

t——試驗天數(shù)（d）。

1.4.2 消化酶指標及測定方法

解剖取樣得到不同飼料組石斑魚的腸、胃及肝胰臟組織，樣品低溫保存，使用南京建成生物工程研究所的標準試劑盒方法，測定蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶活性。

在測定消化酶活性前將組織冰浴勻漿、離心預處理，并通過預試驗確定稀釋倍數(shù)后進行正式測定。

①胃蛋白酶：胃蛋白酶可水解蛋白質(zhì)產(chǎn)生含酚的氨基酸，把酚試劑還原成藍色物質(zhì)，通過比色測定胃蛋白酶活力。

②胰蛋白酶：胰蛋白酶能催化水解底物精氨酸乙酯的酯鏈，使其在253 nm處吸光度值升高，根據(jù)吸光度的變化可以計算出酶的活力。

③脂肪酶：甘油三酯和水制成的膠乳，因其膠束對入射光的吸收及散射而具有乳濁特性。膠束中的甘油三酯在脂肪酶作用下發(fā)生水解，使膠束分裂，散射光或濁度因而減低。減低的速率與脂肪酶活力有關。

④淀粉酶：淀粉酶水解淀粉生成葡萄糖、麥芽糖和糊精，在底物濃度已知并且過量的情況下，加入碘液與未水解的淀粉結合成藍色復合物，測定吸光值推算出水解的淀粉量，從而計算出淀粉酶的活力。

1.4.3 水質(zhì)指標及測定方法

為了檢測不同飼料組石斑魚生長水質(zhì)環(huán)境，在試驗末期對不同飼料組養(yǎng)殖石斑魚的水質(zhì)進行測定，連續(xù)3 d 13:00定時取水樣，并在當天測定水體中氨氮、亞硝酸氮及化學需氧量（COD）。氨氮測定采用納氏試劑法；亞氮測定采用重氮-偶氮法；COD測定采用優(yōu)化了的堿性高錳酸鉀法，即烘箱加熱代替電爐加熱。

1.5 統(tǒng)計分析方法

本試驗所有數(shù)據(jù)結果通過統(tǒng)計軟件SAS9.1進行方差分析，采用LSD法進行多重比較。顯著性水平為P＜0.05。

2 結果

2.1 生長性能

試驗魚攝食量變化曲線見圖1。由圖1可見，隨著飼糧抗腸炎功能蛋白粉添加量增加，各處理試魚采食量逐漸上升，組間差異愈來愈明顯。尤以3#組優(yōu)勢明顯，2#組較好。值得一提的是，從8月期間的2次應激（突然降溫、測水質(zhì)停食）采食變化特征曲線看出，3#、2#組的抗應激效應顯著優(yōu)于0#、1#組，產(chǎn)生了較大組間差異。

圖1 抗腸炎功能蛋白粉對工業(yè)化養(yǎng)殖點帶石斑魚攝食量效應曲線

試驗生長性能結果如表2、圖2所示，隨著基礎飼料中抗腸炎功能蛋白粉添加量的增加，點帶石斑魚的生長速度得到明顯改善。平均增重率呈現(xiàn)遞增趨勢，1#組與對照0#組相比差異不顯著，但1#組增重率提高了7.8%(P＞0.05)；2#、3#組分別顯著高于對照組9.3%和13.9%(P＜0.05)。1#、2#、3#組飼料系數(shù)比對照0#組分別顯著降低9.4%、10.3%、12.0%(P＜0.05)。此結果特征與采食變化曲線規(guī)律相一致。

表2 抗腸炎蛋白粉對工業(yè)化養(yǎng)殖點帶石斑魚生長性能的影響（n=3）

圖2 抗腸炎蛋白粉對工業(yè)化養(yǎng)殖點帶石斑魚增重率及飼料系數(shù)的影響

2.2 養(yǎng)殖水環(huán)境

從試驗水環(huán)境主要指標測定結果(見表3)可見,各組的NO2--N和COD都沒有顯著差異(P＜0.05),分別維持在0.14 mg/l和3.67 mg/l左右。而不同處理組水質(zhì)NH3-N出現(xiàn)顯著差異,隨抗腸炎蛋白粉添加量增加,水環(huán)境中氨氮含量出現(xiàn)遞增特征。2#、3#組比對照0#組增加28.8%、42.4%(P＜0.01)，比1#組提高23.2%、36.2%(P＜0.05、P＜0.01)，1#組與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)。水質(zhì)指標結果特征也與采食量變化曲線、增重率和飼料系數(shù)變化規(guī)律相符合。

表3 抗腸炎蛋白粉影響工業(yè)化養(yǎng)殖點帶石斑魚水環(huán)境主要指標情況（n=3，mg/l）

2.3 消化酶活力

胃消化酶活力測定結果如表4所示，蛋白酶、脂肪酶活力值在腸胃中較低，各試驗組間蛋白酶活力差異顯著，但與對照組相比變化規(guī)律不明顯。脂肪酶活力差異不顯著，淀粉酶活力值在腸胃中較高，隨抗腸炎蛋白添加量提高，出現(xiàn)先升后降的特征，1#、2#組分別極顯著和顯著高于對照0#組24.1%、10.9%（P＜0.01、P＜0.05），分別極顯著高于3#組31.8%、17.7%（P＜0.01）；1#組也顯著高于2#組12.0%（P＜0.05），3#組與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

表4 抗腸炎蛋白粉對工業(yè)化養(yǎng)殖點帶石斑魚腸胃消化酶活力的效應（n=3）

試驗各組魚的肝胰臟消化酶活力值（見表5、圖3）均較高，脂肪酶活力差異不顯著。蛋白酶活力隨抗腸炎蛋白添加量提高而顯著增加，3#、2#、1#組比對照0#組分別極顯著或顯著提高56.4%(P＜0.01)、36.1%(P＜0.01)、14.4%(P＜0.05)；3#、2#組比1#組分別極顯著或顯著提高36.6%(P＜0.01)、19.0%(P＜0.05)；3#組比2#組顯著提高14.9%(P＜0.05)。肝胰臟淀粉酶活力變化特征與腸胃相似，隨抗腸炎蛋白添加量提高，出現(xiàn)先升后降的趨勢，2#組分別顯著高于對照0#、3#組10.9%、12.8%(P＜0.05)；1#組分別顯著高于對照0#、3#組7.6%、9.5%(P＜0.05)；其余組間差異不顯著（P＞0.05）。

表5 抗腸炎蛋白粉對工業(yè)化養(yǎng)殖點帶石斑魚肝胰臟消化酶活力的效應（n=3）

圖3 抗腸炎蛋白粉對工業(yè)化養(yǎng)殖點帶石斑魚肝胰臟蛋白酶、淀粉酶活力的效應

3 討論

3.1 抗腸炎蛋白粉對生長及應激的效應

抗腸炎蛋白添加劑，主要通過增強消化道健康來提高動物生長性能和改善機體健康狀況，這一功能特性在本試驗生長性能結果中表現(xiàn)突出。從其生長性能指標變化規(guī)律看，隨著基礎飼料中抗腸炎蛋白粉添加量的增加，點帶石斑魚的生長速度和飼料利用率明顯提高，增重率比對照組分別提高了7.8%～13.9%，飼料系數(shù)比對照組降低9.4%～12.0%，但添加梯度組間差異不顯著。

養(yǎng)殖動物生長期采食量的高低標志著生長快慢，也間接反映機體健康狀況。本試驗各處理組試魚全期攝食量變化曲線（圖1）顯示，隨著飼糧抗腸炎蛋白粉添加量增加，各處理試魚采食量逐漸上升高于對照組，且組間差異愈來愈明顯。尤以3#、2#組采食優(yōu)勢明顯。特別是試驗在8月份連續(xù)2次應激（突然降溫、測水質(zhì)停食），使3#、2#組的采食量下降及回升的幅度顯著優(yōu)于0#、1#組，產(chǎn)生了較大組間差異。故本研究的新發(fā)現(xiàn)是，飼糧添加2‰以上抗腸炎蛋白粉后，顯著增強了魚的抗應激能力，或者說顯著減緩了試魚應激反應的副作用，使應激后試魚采食量下降幅度顯著減緩，從而有力阻止了生長速度的停止或下降，整體上提高了增重率和飼料利用率。這是抗腸炎蛋白粉提高試魚生長性能的原因所在。其作用機理是否與減緩腸道疾患從而間接提高機體免疫應激能力有關，還需進一步分析和探究。

魚類養(yǎng)殖中，經(jīng)常會出現(xiàn)不同程度和類型的應激，抗應激添加劑在水產(chǎn)飼料中的應用研究頗豐。孫克年[8]總結了以下12種抗應激添加劑：維生素C、核苷酸、腐植酸、海帶、甜菜堿、小肽、蝦青素、檸檬苦素類似物、肉毒堿鹽酸鹽、糖萜素、幾丁聚糖、中藥添加劑。這些添加劑都有增強養(yǎng)殖魚免疫力、提高存活率、減少病害、提高應激能力的表現(xiàn)。另外，N-乙酰-5-甲氧基色胺能夠減小塞內(nèi)加爾鰨的應激負作用[9]。而雞蛋卵黃抗體作為一種治療劑，不僅在治療人體腸道傳染病上有良好效果[10]，在水產(chǎn)養(yǎng)殖魚飼料上也有應用。比如：卵黃免疫球蛋白能夠預防鯽魚敗血癥[11]，幫助虹鱒抵抗魯氏耶爾森菌的入侵[12]；卵黃抗體還能識別太平洋鮭體內(nèi)發(fā)育和成熟的微孢子蟲[13]等。本試驗證明，抗腸炎蛋白粉顯著減緩應激反應副作用的效應，對魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)意義重大，也是該產(chǎn)品推廣應用的獨特性能所在。

Mahdavi等[1]研究證明，卵黃抗體能降低養(yǎng)殖動物空腸球狀細胞和淋巴濾泡的數(shù)目；使日增重和免疫保護率顯著提高，死亡率顯著降低[2-3]。本試驗發(fā)現(xiàn)，抗腸炎蛋白粉顯著減緩試魚應激反應副作用的結果，與前人研究結果有相似之處。

3.2 抗腸炎蛋白粉對水環(huán)境的影響

關于飼料中添加抗腸炎蛋白粉對養(yǎng)殖水環(huán)境的影響研究，尚未見有文獻報道。本試驗結果表明，試魚采食含有抗腸炎蛋白粉的飼料后，對養(yǎng)殖水的亞硝酸氮（NO2--N）和化學耗氧量（COD）都沒有顯著影響，而對水氨氮（NH3-N）含量影響較大。隨抗腸炎蛋白粉添加量增加，水氨氮含量出現(xiàn)遞增特征，2#、3#組比對照0#組極顯著增加28.8%、42.4%（P＜0.01），比1#組也顯著提高23.2%～36.2%（P＜0.05、P＜0.01）。其原因是，隨著抗腸炎蛋白粉添加量遞增，試魚采食量明顯遞增，尤以2#、3#組采食量提高顯著；同時增重率也在遞增。2#、3#組采食多、體重大，故排除氨氮量更多一些。水質(zhì)氨氮指標結果的變化特征與本試驗采食量變化曲線相吻合，也與增重率和飼料系數(shù)變化規(guī)律基本一致。

3.3 抗腸炎蛋白粉對消化酶的作用

抗腸炎蛋白粉等卵黃抗體添加劑對魚類消化酶效應和作用機制的研究目前尚未見有文獻報道。本試驗表明，抗腸炎蛋白粉對蛋白和淀粉消化酶產(chǎn)生了顯著影響，而對脂肪酶作用不明顯。

對蛋白酶的作用主要發(fā)生在肝胰臟，隨抗腸炎蛋白粉添加量遞增，蛋白酶活力顯著或極顯著遞增，提高的幅度范圍達14.4%～56.4%，以2‰和3‰添加量的促進效應較高。對淀粉酶的作用，不論是胃腸還是肝胰臟，隨抗腸炎蛋白添加量提高，均出現(xiàn)先升后降的特征，1‰和2‰添加量的效應顯著，胃腸淀粉酶活力比對照組分別提高了24.1%、10.9%。肝胰臟淀粉酶活力比對照組分別提高7.6%、10.9%。

分析其可能原因為，飼料中添加適宜量的抗腸炎蛋白粉后，減少了試魚腸道炎癥、改善了消化道健康，從而提高了營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，間接刺激了消化酶活力提高。至于其對脂肪酶的效應不明顯，其原因有待進一步探尋。

4 結論

①本試驗研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加2‰以上抗腸炎蛋白粉后，顯著降低試魚應激反應副作用即顯著減緩采食量下降幅度，這是抗腸炎蛋白粉提高生長性能的原因所在，對魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)中意義重大。

② 基礎飼料中添加1‰～3‰的抗腸炎蛋白粉，明顯提高點帶石斑魚的生長性能，增重率和飼料系數(shù)比對照組分別提高7.8%～13.9%和降低9.4%～12.0%（P＜0.05）。隨抗腸炎蛋白粉添加量增加，水體中氨氮含量出現(xiàn)遞增特征。

③本試驗表明，抗腸炎蛋白粉對蛋白質(zhì)和淀粉消化酶活力產(chǎn)生了顯著影響，而對脂肪酶活力作用不明顯。與對照組相比，肝胰臟蛋白酶活力顯著或極顯著提高14.4%～56.4%；添加1‰和2‰抗腸炎蛋白粉，胃腸淀粉酶活力分別提高了24.1%、10.9%，肝胰臟淀粉酶活力分別提高7.6%、10.9%（P＜0.05）。

④本試驗研究證明，工業(yè)化養(yǎng)殖點帶石斑魚幼魚膨化顆粒飼料中，抗腸炎蛋白粉的適宜添加量為2‰～3‰。