苗則彥，白元俊，李 穎，趙 楊，趙奎華

（遼寧省農業(yè)科學院，遼寧省農作物有害生物控制重點實驗室，沈陽 110161）

十字花科根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woron）侵染引起的一種重要病害，世界各地均有發(fā)生，我國云南、四川等地該病的發(fā)生面積已超過65%，嚴重田塊的產量損失超過50%[1]。2011年調查發(fā)現遼寧省沈陽市新民地區(qū)嚴重地塊發(fā)病率達到90%以上，直接危害十字花科作物生產。培育抗病品種是防治十字花科根腫病的最有效措施之一。由于該病原菌存在明顯的致病力分化現象，因此明確病原菌的生理小種或致病型類型十分重要。目前我國關于根腫病菌生理小種鑒定報道很少，謝文瑞等利用ECD（European club root differential host）方法測定臺灣省7個地區(qū)的根腫病菌生理小種，分別為ECD16/0/0和ECD16/0/31菌系[2]。沈向群首次利用Williams方法明確我國大白菜根腫病菌生理小種主要種群分布，鑒定出4號、2號、7號、10號、11號生理小種[3]。國際上除Williams[4]和ECD[5]鑒別系統(tǒng)之外，還有Somé[6]和Kuginuki[7]鑒別系統(tǒng)，我國目前無這兩種鑒別系統(tǒng)的應用和介紹。

根腫病菌是一種專性寄生菌，寄生于寄主根部薄壁組織內或以休眠孢子存在于土壤中，體外培養(yǎng)根腫病菌均未獲得成功，該病原菌的擴繁只能通過活體寄生的方式完成。根腫病菌的休眠孢子體積較小難于分離和檢測，單個病原菌孢子的分離和擴繁成功率極低，為根腫病菌生理小種的深入研究帶來困難。楊佩文研究了根腫病菌休眠孢子的分離技術[8]，但單孢子分離方法，單個孢子接種方法為我國研究空白。本文對根腫病菌生理小種或致病型鑒別系統(tǒng)、病原菌單孢子分離方法及病原菌接種方法進行綜述。

1 生理小種鑒別系統(tǒng)

Honig在1931年首先發(fā)現十字花科作物根腫病菌（Plasmodiophora brassicae）存在致病力分化現象[9]，Ayers和Lammerink對該病原菌分化進行研究[10-11]。很多學者利用不同鑒別方法，在世界不同地區(qū)如歐洲[5-6,12]、亞洲[13]、大洋洲[14]、北美洲[15]等陸續(xù)報道不同十字花科作物上的根腫病菌致病力分化情況。

國際上已有4套鑒別系統(tǒng)用于根腫病菌生理小種和致病型的鑒定，Williams和ECD鑒別系統(tǒng)應用較為廣泛，劉勇已就這兩種鑒別方法及優(yōu)缺點進行較全面的綜述[16]。Somé和Kuginuki鑒別系統(tǒng)克服Williams和ECD鑒別系統(tǒng)中的部分缺欠，在國際上已被部分研究人員應用。

1.1 Somé鑒別系統(tǒng)

Somé在研究法國根腫病菌時發(fā)現Williams和ECD鑒別系統(tǒng)具有一定的局限性，可能是不同地域病原菌致病型不同的原因[6]。這兩套鑒別系統(tǒng)不能將病原菌明確區(qū)分。因此，Somé選用ECD鑒別系統(tǒng)中的兩個品種Nevin（ECD06）和Wilhelmsburger（ECD10），又另外選用Brutor品種（Spring oilseed rape），建立由3個品種組成的鑒別系統(tǒng)[6]，根據Somé[6]研究結果，建立能區(qū)分8種致病型的鑒別寄主譜（見表1）。Crute等[17]和Voorips[12]曾提出用致病型（Pathotype）代替生理小種（Race）的概念，Somé鑒別系統(tǒng)中病菌的分類采用致病型而非生理小種[6]。研究人員均使用這個系統(tǒng)進行根腫病菌致病型的鑒定[15,18]。ECD、Williams和Somé鑒別系統(tǒng)分別含有15個、4個和3個鑒別寄主，理論上相應可鑒定出125個、16個和8個致病型，因此在ECD中鑒定為不同的致病型在Williams和Somé鑒別系統(tǒng)中為同一種致病型的概率相對較高。Williams和Somé鑒別系統(tǒng)的鑒別寄主少，實用性和可操作性更強，Somé根據法國根腫病菌的分化特點，雖然僅選用3個鑒別寄主，但可對病原菌的致病型進行有效鑒定，值得各國學者研究和借鑒。

1.2 Kuginuki鑒別系統(tǒng)

Kuginuki在研究日本根腫病菌時發(fā)現，利用Williams和ECD鑒別系統(tǒng)很難將根腫病菌致病型真正區(qū)分開來[7]。利用日本抗性品種雜交F1代和Brassica rapa品種可以進一步區(qū)分在Williams和ECD鑒別系統(tǒng)中認為是相同生理小種的菌株。Kuginuki選用Willams鑒別系統(tǒng)中的4個品種，選用ECD鑒別系統(tǒng)中的ECD05、ECD04、ECD03、ECD02、ECD01品種，選用日本的抗性品種雜交F1代CR W-1116、CR Kukai 65、CR Kanko、CR Utage 70、CR Ryutoku、Muso，另外選用Gelria R、Siloga、Chinese cabbage parental line No.4共18個品種用于病原菌的鑒定[7]。Hatakeyama在Kuginuki鑒別系統(tǒng)的基礎上，對鑒別寄主的種類稍加改變，試驗又一次證明Williams和ECD鑒別系統(tǒng)不能有效區(qū)分小種類型，Hatakeyama和Kuginuki鑒別系統(tǒng)在日本的根腫病菌小種鑒定中起重要作用，它比Williams和ECD鑒別系統(tǒng)更加精確，但鑒別寄主較多且適用地區(qū)有限[15]。

目前國內使用Willams鑒別系統(tǒng)，已鑒定出4號生理小種，且在我們的研究中發(fā)現4號生理小種已成為東北地區(qū)的優(yōu)勢小種，根據Willams鑒別系統(tǒng)的命名原則，使4個鑒別寄主全部感病時的病原菌菌株為4號生理小種。可以預見當病原菌致病力進一步分化，出現致病力強于4號生理小種時，Willams鑒別系統(tǒng)將不能滿足鑒定需要，當前亟需調整和補充新的鑒別寄主。因此有必要學習和借鑒Somé和Kuginuki鑒別系統(tǒng)的制定過程，形成一套新的適合我國根腫病菌鑒定的鑒別寄主譜。

表1 Somé十字花科根腫病菌鑒別系統(tǒng)Table 1 System for the determination of pathotype of Plasmodiophora brassicae with Somé

2 病原菌單孢子分離方法

研究人員直接用田間發(fā)病的根部腫塊制成孢子懸浮液進行人工接種，完成生理小種或致病型的鑒定[6,19-20]。Strelkov等研究發(fā)現，人工接種鑒別寄主后，病情指數波動較大或出現既不屬于抗病反應也不屬于感病反應的中間類型，難以命名生理小種或致 病 型[21]。Williams[4]，Kuginuki[7]，Toxopeus[22]也 發(fā)現同樣現象。Williams[4]和Toxopeus[22]認為可能是病原菌存在異質性。Xue等研究發(fā)現在同一地塊的根腫病菌有多種致病型同時存在[18]。Kuginuki認為可能是鑒別寄主存在遺傳異質性[7]。目前已有相當多的學者采用單孢子分離物（Single resting sporederived isolates）來進行根腫病菌生理小種鑒定研究[17-18]，利用單個休眠孢子分離方法可比較準確評估病原菌的毒力，有助于研究寄主和病原物之間的相互關系[6]，因此相繼出現病原菌單個休眠孢子分離技術，即瓊脂法和液滴法。

2.1 病原菌單孢子分離方法—瓊脂法

Tinggal和Webster最先使用瓊脂法[23]。Jones等進行改進[20]，他將根腫病菌孢子懸浮液稀釋為3×104個·mL-1，取一滴菌懸液放在含有3%的瓊脂平板上，散開后用160倍的顯微鏡觀察，當1個孢子與其他孢子明顯分開時，用顯微鏡上的微型打孔器來切取帶有孢子的圓形瓊脂餅，并檢測這個瓊脂餅是否移出。這種方法比平針挑取法好，降低了挑出其他孢子的可能性。Xue等研究表明，如果不借助特殊儀器，移出一小塊瓊脂很難，另外瓊脂可能會阻止孢子直接接觸根毛影響接種效果[18]。

將甘藍（Brassica oleracea）種子放在裝有濕濾紙的培養(yǎng)皿中萌發(fā)，24 h后將發(fā)芽的種子放在一個直徑為5 mm的濾紙片上，將這個濾紙片放在裝有無菌肥料的直徑為9 cm的塑料盆表面，并置于高濕條件下培養(yǎng)5 d（高濕條件十分必要）。胚根長到肥料中，茂密的根須布滿濾紙片，在根須上滴一滴根的浸出液。用一個細的金屬絲挑起含有單個根腫病菌孢子的瓊脂塊放在液滴里。接種后用塑料袋保濕，25℃黑暗培養(yǎng)，避免光照，以免影響孢子萌發(fā)。2 d后將塑料袋移走，將塑料盆放在未感染根腫病菌的溫室中。用滅菌的導管向盆中澆水。接種約9周后，小心地將植株從肥料中取出，調查病害發(fā)生情況。沒有病菌接種的幼苗隨機排列在接種幼苗中，當未接種幼苗沒有出現根腫癥狀時，表明試驗成功。Fahling等將孢子懸浮液進行純化，通過2次梯度離心[2 000×g，15 min，16%和32%（W/V）蔗糖]收集32%（W/V）離心后的上清液，水洗，配成孢子懸浮液104個·mL-1，取100 μL孢子懸浮液在薄的1%瓊脂上散開，30 min后將瓊脂切成0.5 mm2小塊，用兩個針在顯微鏡下將含有1個孢子的瓊脂小塊取出，放在已萌發(fā)4 d的根表面，10周后發(fā)病植株根部表現癥狀。

Somé將孢子懸浮液經過500、250和100 μm膜過濾，孢子在5 000 r·min-1、4℃下離心5 min，棄上清將沉淀用蒸餾水重新懸浮，反復4次[6]。將沉淀物貯存在4℃條件下，使用期限不超過5 d。取1%瓊脂倒在一玻片上，加一滴孢子懸浮液在其表面擴散，幾分鐘后表面風干，用刀切成1 mm2小塊，用針將含有一個孢子的瓊脂塊取出，放在已萌發(fā)3～6 d的白菜根上（生長在蛭石上），保濕、20℃、黑暗24～48 h后移入裝有無菌土∶泥炭土（1∶1）直徑8 cm的塑料盆中，置于夜晚19℃、白天21℃、16 h光照的生長箱中，接種9～14周后發(fā)病，成功率大約為9.6%。

2.2 病原菌單孢子分離—液滴法

Xue取新鮮、-80℃貯存或在4℃下密封袋中保存2個月的部分腐爛根腫瘤3 g，加入50 mL無菌水中，用攪拌器制成勻漿，8層紗布過濾，將含有休眠孢子的濾液進行離心（1 000×g，4℃，10 min），沉淀物用無菌水懸浮再離心5次，將沉淀物保存在4℃下備用，保存期限不超過2 d[18]。

將休眠孢子懸浮在磷酸鈉鹽緩沖液（pH 8.0，10 mmol·L-1）或5%（V/V）甘油溶液中，濃度為2×103個·mL-1。Xue等認為用5%的甘油配制孢子懸浮液可避免孢子集聚[18]。取1滴0.5 μL孢子懸浮液置于100倍顯微鏡下觀察，當確認只有1個孢子時，輕輕吸取液滴，接種于已萌發(fā)1～2周的白菜苗根部。將苗置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，皿中加入無菌水（pH 6.5～7.0）或自來水（pH 6.0），可用HCl調pH，然后置于21℃、黑暗條件下，培養(yǎng)2 d后移栽到直徑7.5 cm裝土的塑料缽中，光照24℃、黑暗18 ℃，每天光照16 h（180 μmol·m-2·s-1），加入pH 6.0自來水，使土壤始終處于飽和狀態(tài)，培養(yǎng)19 d后，可1周施肥1次（15N-30P-15K）。Xue等認為，在吸取液滴的過程中可能會使相當多的孢子留在移液管末端或留在玻片中，導致侵染率降低[18]。這種方法只要孢子懸浮液濃度適宜，每小時可接種2～4個幼苗，接種成功率達到4%～17%。

Voorrips則將孢子懸浮液稀釋為500個·mL-1[24]。吸1滴2 μL孢子懸浮液放在已滅菌的蓋玻片上，在顯微鏡300倍下逐行仔細觀察，如果只有1個或沒有休眠孢子，則再仔細觀察1遍，如果確定有1個孢子，則在450倍下再重新觀察確定。用含有1個或0個休眠孢子的懸浮液進行接種。用萌發(fā)5～8 d白菜苗（品種：ECD05）的根放在蓋玻片上去吸這滴孢子懸浮液。隨后將這株幼苗移入1.5 mL離心管中，取1 mL無菌水沖洗蓋玻片，并將洗液沖入離心管中，在培養(yǎng)箱（23 ℃，80 μE·m-2·s-1，每天光照16 h）中培養(yǎng)，48 h后放入18℃溫室中，用無菌復合肥盆栽。試驗設置不接種為對照，7周后調查，結果表明分離的164個單個休眠孢子只有2株接種成功，161滴0個休眠孢子的懸浮液接種后，沒有表現出癥狀，160個未接種對照植株沒有發(fā)病。試驗本身是成功的，但接種效率很低。Kageyama等將孢子懸浮液稀釋為2×103個·mL-1，吸取0.5 μL放在載玻片上，顯微鏡檢查后確認只有1個孢子時，將這個載玻片放在滅菌土表面，已萌發(fā)1 d的幼苗放在液滴上，上面覆蓋少量無菌土[25]。也許因為休眠孢子吸附在蓋玻片上，這種方法的侵染率很低，為0～4.2%。

3 病害鑒定方法及分級標準

蘸根法、點滴法和菌土法是目前根腫病菌生理小種或致病型鑒定采用的主要方法，但不同研究人員采用的病原菌接種濃度不同、接種后植株管理條件不同以及抗、感病反應型確定的臨界點不同等，使得試驗結果缺乏可比性。國內部分學者對根腫病菌最佳接種方法[26-27]和適宜病原菌接種濃度[28]等進行研究報道，試驗選用的品種為非鑒別寄主品種，感病性不同且試驗目的存在差異，還不能視為對生理小種鑒定方法的研究。一定區(qū)域內根腫病菌生理小種或致病型的鑒定應采用統(tǒng)一方法，嚴格規(guī)范試驗條件，避免產生人為誤差，國內目前缺乏規(guī)范的不同十字花科作物生理小種鑒定方法的研究。

3.1 蘸根法

Strelkov取2.5～3 g干的根腫瘤加入研缽中研磨，加入50 mL滅菌蒸餾水，8層紗布過濾，將孢子濃度配制成2×107～3×108個·mL-1，將在無菌濾紙上萌發(fā)7 d的幼苗根部浸在孢子懸浮液中，10 s后置于6 cm3的塑料缽中，澆透水后放在培養(yǎng)室中[15]。白天21℃/夜間18℃，16 h光照，或放在溫室中（20±2）℃，16 h光照。接種后1周內土壤水分始終處于飽和狀態(tài)，然后根據需要進行澆水、施肥。每個品種24株，4次重復。Xue用無菌水將根腫病菌配成濃度為1×107個·mL-1孢子懸浮液[18]。在無菌濾紙上萌發(fā)種子，7 d后將白菜根浸在孢子懸浮液中，10 s后置于4 cm2的塑料缽中底部無排水孔，溫室大棚中白天21℃，16 h光照（自然光補充高壓鈉燈）夜間18℃黑暗，接種后1周，用自來水（pH 6.0）澆透，以后每周施肥1次（15N-30P-15K）。接種6周后調查病害發(fā)生程度，病情分級標準：0級：無癥狀；1級：有少量小根瘤，體積少于根的1/3；2級：中度結瘤，小的和中等大小的腫瘤，體積是根的1/3至1/2；3級：重度結瘤，中等至大的腫瘤，體積超過根的2/3。Voorrips等認為孢子懸浮液最小濃度為1.0×107個·mL-1是接種成功的最適宜濃度[29]。Strelkov將DI=50%做為抗感反應的臨界點，DI≥50%為感病反應，DI＜50%為抗病反應。Xue則利用方差分析和LSD（Least significant difference）進行抗病反應和感病反應分析[18]。

3.2 點滴法

Somé建立自己的鑒別系統(tǒng)，采用點滴法進行接種[6]。將泥炭∶土壤∶沙子（2∶1∶1），pH 5.5～6.3的基質裝入7.5 cm2塑料盆中，每盆播5粒種子，種子萌發(fā)6～10 d后接種。用移液管在植株根部滴入1 mL孢子懸浮液，濃度為2×107～1×108個·mL-1，每個品種10～20株。土壤保持濕潤，接種5～6周后調查。分級標準：n0：無癥狀；n1：次生根上長小的腫瘤；n2：側根上長有很多腫瘤；n3：主根和次生根上長有大量腫瘤?？垢蟹磻R界點為25%。Somé在參照Williams計算方法的基礎上進行改進，采用不同于普遍應用的病害病情指數計算公式。

Agarwal等將種子播種在裝有無菌土的直徑125 mm的育苗盒中，每盒放1粒種子，然后將育苗盒置于溫室中（20±2）℃。15個品種12次重復，共180株[30]。播種后3～4周（2片真葉期）接種，接種前土中澆水，在土壤表面滴入200 μL孢子懸浮液（108個·mL-1），8周后調查病害發(fā)生情況。0=無癥狀；1=腫瘤占根體積低于10%；2=腫瘤占根體積10%～50%；3=腫瘤占根體積多于50%。病情指數DI=0為抗性反應，DI≥33%為感病反應。

3.3 菌土法

Kuginuki等利用菌土法進行接種，將無菌土裝入8 cm2盆中（土壤pH 5.5～6.0），在其中挖一個6 cm長、2 cm寬、3 cm深的坑，將菌土（5×106個孢子·g-1干土）放入其中[7]，每盆播1個種子，每個品種播10粒種子3次重復。0級：根部無腫瘤；1級：少量小的腫瘤；2級：中等腫瘤；3級：嚴重腫瘤。

4 展望

十字花科根腫病幾乎在全國范圍內發(fā)生，隨著研究的不斷深入，目前亟需建立一套科學、實用、適合我國病原菌致病力分化特點的鑒別系統(tǒng)。應該篩選出適易的鑒別寄主、摸索出準確快速的病原菌單孢子分離方法，規(guī)范病原菌人工接種過程，建立以大白菜、蘿卜、甘藍等不同十字花科作物的生理小種或致病型鑒定規(guī)程。

[1]楊家鸞.昆明菜區(qū)大白菜根腫病防治技術研究初探[J].云南農業(yè)大學學報,2002,17(4):342-344.

[2]謝文瑞,黃一修.臺灣十字花科蔬菜根瘤病菌的病原性生理分化[J].植物保護學會會刊（臺灣?。?1988,30(4):393-398.

[3]沈向群,聶凱,吳瓊,等.大白菜根腫病主要生理小種種群分化鑒定初報[J].中國蔬菜,2009(8):59-62.

[4]Williams P H.A system for the determination of races of Plasmodiophora brassicae that infect cabbage and rutabaga[J].Phytopathology,1966,56:624-626.

[5]Buczacki S T,Toxopeus H,Mattusch P,et al.Study of physiological specialization in Plasmodiophora brassicae:Proposals for attempted rationalization through an international approach[J].Transactions of the British Mycological Society,1975,65:295-303.

[6]Somé,Manzanares M J,Laurens F,et al.Variation for virulence on Brassica napus among Plasmodiophora brassicae collections from France and derived single-spore isolates[J].Plant Pathology,1996,45:432-439.

[7]Kuginuki Y,Hiroaki Y,Hirai M.Variation in virulence of Plasmodiophora brassicae in Japan tested with clubroot-resistant cultivars of Chinese cabbage(Brassica rapa var.pekinensis)[J].European Journal of Plant Pathology,1999,105:327-332.

[8]楊佩文,李家瑞,楊勤忠,等.十字花科蔬菜根腫病菌休眠孢子的分離與檢測[J].云南農業(yè)大學學報,2002,17(3):301-302.

[9]Honig F.Der Kohlkropferreger(Plasmodiophora brassicae Wor.)[J].Gartenbauwissenschaft,1931(5):116-125.

[10]Ayers G W.Races of Plasmodiophora brassicae[J].Canadian Journal of Botany,1957,35:923-932.

[11]Lammerink J.Pathologic specialisation of Plasmodiophora brassicae Wor.[J].New Zealand Journal of Agricultural Research,1964(7):1,37-41.

[12]Voorrips R E.Plasmodiophora brassicae:Aspects of pathogenesis and resistance in Brassica oleracea[J].Euphytica,1995,83:139-146.

[13]Hatakeyama K,Fujimura M,Ishida M,et al.New classification method for Plasmodiophora brassicae field isolates in Japan based on resistance of F1cultivars of Chinese cabbage(Brassica rapa)to clubroot[J].Breeding Science,2004,54:197-201.

[14]Donald E C,Cross S J,Lawrence J M,et al.Pathotypes of Plasmodiophora brassicae,the cause of clubroot,in Australia[J].The Annals of Applied Biology,2006,148:239-244.

[15]Strelkov S E,Manolii V P,Cao T,et al.Pathotype classification of Plasmodiophora brassicae and its occurrence in Brassica napus in Alberta,Canada[J].Phytopathology,2007,155:706-712.

[16]劉勇,羅一帆,黃小琴,等.蕓薹根腫菌生理小種鑒別方法研究進展[J].中國油料作物學報,2011,33(4):420-426.

[17]Crute I R,Gray A R,Crisp P,et al.Variation in Plasmodiophora brassicae and resistance to clubroot disease in Brassicas and allied crops a critical review[J].Plant Breeding Abstract,1980,50:91-104.

[18]Xue S,Cao T,Howard R J,et al.Isolation and variation in virulence of single-spore isolates of Plasmodiophora brassicae from Canada[J].Plant Disease,2008,92:456-462.

[19]Cho W D,Kim W G,Takahashi K.Occurrence of clubroot in cruciferous vegetable crops and races of the pathogen in Korea[J].Plant Pathol,2003,19(1):64-68.

[20]Jones D R,Ingram D S,Dixon G R.Characterization of isolates derived from single resting spores of Plasmodiophora brassicae and studies of their interaction[J].Plant Pathol,1982,31:239-246.

[21]Strelkov S E,Tewari J P,Smith,et al.Characterrization of Plasmodiophora brassicae populations from Alberta[J].Can J Plant Pathol,2006,28:467-474.

[22]Toxopeus H,Dixon G R,Mattusch P.Physiological specialization in Plasmodiophora brassicae;an analysis by international experimentation[J].Trans Br Mycol Soc,1986,87:279-286.

[23]Tinggal S H,Webster J.Technique for single spore infection by Plasmodiophora brassicae[J].Trans Br Mycol Soc,1981,87:179-190.

[24]Voorrips R E.Characterization and interaction of single-spore isolates of Plasmodiophora brassicae[J].Eur Plant Pathol,1996,102:377-383.

[25]Kageyama K,Kamimura Y,Hyakumachi M.A simple inoculation method with a single resting spore of Plasmodiophora brassicae[J].Ann Phytopathol Soc Jpn,1995,61:415-418.

[26]李妍,謝學文,向文勝,等.白菜根腫病的接種方法[J].植物保護學報,2011,38(1):95-96.

[27]司軍,李成瓊,肖崇剛,等.甘藍根腫病接種方法的研究[J].西南農業(yè)大學學報,2003,25(3):216-219.

[28]周永紅,孫保亞,沈向群.大白菜根腫病抗病接種濃度的研究[J].遼寧農業(yè)科學,2007(3):34-35.

[29]Voorrips R E,Visser D L.Examination of resistance to clubroot in genotypes of Brassica oleracea using a glasshouse seedling test[J].Netherlands Journal of Plant Pathology,1993,99:269-276.

[30]Agarwal A,Kaul V,Faggian R,et al.Development and use of a model system to monitor clubroot disease progression with an Australian field population of Plasmodiophora brassicae[J].Austration Plant Pathology,2009,38:120-127.