鄒德堂，馬 婧，王敬國(guó)，劉化龍，孫 健，王志欣，黃瑩瑩，武 琦，興 旺

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

鹽堿地大多分布在熱帶、溫帶和寒帶地區(qū)。水稻是一種對(duì)鹽堿中度敏感的作物，土壤鹽堿化是導(dǎo)致水稻減產(chǎn)的重要原因之一，不同程度的脅迫發(fā)生在水稻各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，在鹽堿稻作區(qū)的直播田中，常發(fā)生水稻幼苗前期的鹽堿危害。水稻成苗率的降低及有效光合群體未建立是因水稻在幼苗前期耐鹽堿能力不強(qiáng)所致。因此，水稻幼苗前期的耐鹽堿性，在鹽堿稻作區(qū)是重要的抗性指標(biāo)。近年來(lái)，在鹽堿稻作區(qū)鹽堿對(duì)水稻生產(chǎn)的危害與防治措施[1]、水稻耐鹽堿品種的篩選與培育、與水稻耐鹽堿性相關(guān)的DNA片段的基因克隆與功能分析[2]及水稻耐鹽性QTL的檢測(cè)[3]等領(lǐng)域有深入研究，以分子機(jī)理角度研究水稻鹽堿性遺傳的多數(shù)研究集中在水稻耐鹽性，鮮有報(bào)道水稻耐堿性。

本研究以耐堿性相關(guān)性狀表型值差異較大的兩個(gè)粳稻品種東農(nóng)425和長(zhǎng)白10號(hào)雜交衍生的F2∶3群體作為研究對(duì)象，對(duì)堿脅迫下水稻幼苗前期相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位，為水稻耐堿性相關(guān)基因的QTL精細(xì)定位和耐堿品種選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以產(chǎn)量較高的水稻品種東農(nóng)425和具有較強(qiáng)耐堿性的品種長(zhǎng)白10號(hào)作為親本進(jìn)行雜交，所獲得F2∶3家系中的180個(gè)株系及其親本為試驗(yàn)材料。

1.2 水稻耐堿性鑒定

幼苗前期耐堿性鑒定采用水培法。堿脅迫處理濃度為25 mmol·L-1NaHCO3，以清水為對(duì)照，2次重復(fù)。選取兩親本及其F2∶3家系的180個(gè)株系每份100粒種子，打破休眠后，用3%次氯酸鈉浸泡30 min，用自來(lái)水沖洗3次。將種子分別播種于基質(zhì)中，并灌溉Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。待幼苗長(zhǎng)至二葉一心時(shí)，選取生長(zhǎng)一致的幼苗移栽至帶孔的泡沫板上，漂浮在濃度為25 mmol·L-1NaHCO3的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的塑料培養(yǎng)盒內(nèi)，每個(gè)材料移栽2排，每排定苗12株，室內(nèi)培養(yǎng)，光照約1 500～2 000 lx，溫度25～28 °C，進(jìn)行25 mmol·L-1堿脅迫處理，同時(shí)設(shè)置對(duì)照。每天以蒸餾水補(bǔ)充自然蒸發(fā)的水分，每隔3 d更換培養(yǎng)液。

處理1周后，調(diào)查幼苗生長(zhǎng)情況、統(tǒng)計(jì)根數(shù)，并用直尺測(cè)量最大根長(zhǎng)（以下簡(jiǎn)稱為根長(zhǎng)），同時(shí)測(cè)定葉綠素含量。以上三個(gè)指標(biāo)及其相對(duì)堿害率用于衡量水稻幼苗前期耐堿性的強(qiáng)弱，計(jì)算公式示于下方。

相對(duì)堿害率（%）=[（對(duì)照性狀值-處理性狀值)/對(duì)照性狀值）]×100%

1.3 DNA提取及QTL檢測(cè)

試驗(yàn)于2011年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地進(jìn)行，分別移栽F2∶3家系（東農(nóng)425/長(zhǎng)白10號(hào)）180個(gè)個(gè)體及親本，在分蘗期每個(gè)家系取5片葉片裝入帶封口的塑料袋，放置于-80℃超低溫冰箱里。依照改進(jìn)的CTAB法[4]提取DNA，測(cè)定DNA濃度，檢測(cè)DNA質(zhì)量，并稀釋DNA原液，備用。

從Gramene網(wǎng)站上下載水稻SSR引物序列（RM系列），篩選600對(duì)引物，篩選父母本間有差異的引物，用于構(gòu)建圖譜。經(jīng)長(zhǎng)白10號(hào)和東農(nóng)425兩個(gè)親本間SSR標(biāo)記多態(tài)性篩選試驗(yàn)，從中篩選兩個(gè)親本間的差異引物，利用這些差異引物對(duì)180個(gè)F2∶3株系的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得群體標(biāo)記基因型數(shù)據(jù)。PCR反應(yīng)體系（總反應(yīng)體系體積為10 μL）包括：1.5 μL 模版 DNA（50～100 ng），1 μL PCR buffer，0.75 μL MgCl2（25 mmol·L-1），0.15 μL dNTP（2.5 mmol·L-1），0.1 μL Taq DNA合成酶（5 U·μL-1），1.5 μL正反向引物（4 μmol·L-1），5 μL超純水。擴(kuò)增程序94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸1 min，10℃保存。利用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染法對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。本研究共篩選出120對(duì)在兩親本間具有多態(tài)性的SSR引物，占總引物數(shù)的20%。將兩親本間具有多態(tài)性的SSR引物，對(duì)F2∶3群體進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，選取在F2∶3群體中差異性較好的88對(duì)引物進(jìn)行F2代遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。

1.4 QTL分析

利用Excel分析軟件分別對(duì)F2∶3群體幼苗前期的根數(shù)、根長(zhǎng)以及葉綠素含量進(jìn)行分析。對(duì)F2代180個(gè)基因型的染色體片段的交換率計(jì)算和連鎖分析采用Mapmaker/Expversion 3.0，把染色體的交換率轉(zhuǎn)為遺傳圖距單位（cM）后，用Kosambi函數(shù)計(jì)算出遺傳距離。用Mapchart 2.1進(jìn)行遺傳連鎖圖譜的繪制。QTL遵循McCouch等[5]命名原則。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻幼苗前期耐堿相關(guān)性狀的表型分析

分別調(diào)查自然條件和堿脅迫條件下，親本及F2∶3家系180個(gè)個(gè)體的根數(shù)、根長(zhǎng)和葉綠素含量及其相對(duì)堿害率，變異范圍和平均值見(jiàn)表1，F(xiàn)3家系次數(shù)分布如圖1所示。

自然條件下，東農(nóng)425的根數(shù)為8條，根長(zhǎng)為6.7 cm，葉綠素含量是21.6 mg·g-1；長(zhǎng)白10號(hào)的根數(shù)為11.7條，根長(zhǎng)為12.2 cm，葉綠素含量是23.5 mg·g-1。在堿脅迫環(huán)境下，東農(nóng)425的根數(shù)是7條，根長(zhǎng)是3.5 cm，葉綠素含量是10.7 mg·g-1；而長(zhǎng)白10號(hào)的根數(shù)是10.3條，根長(zhǎng)是9.2 cm，葉綠素含量是 17.8 mg·g-1。

表1 自然和堿脅迫下F2∶3 家系幼苗前期根數(shù)、根長(zhǎng)和葉綠素含量及其相對(duì)堿害率Table 1 Root number,root length,chlorophyll content and their relative alkaline damage rates at early seedling stage for F2∶3 lines under natural condition and alkaline stress

圖1 堿脅迫下F2∶3 家系幼苗前期根數(shù)、根長(zhǎng)和葉綠素含量及其相對(duì)堿害率的次數(shù)分布Fig.1 Distribution of root number,root length,chlorophyll content and their relative alkaline damage rates at early seedling stage in F2∶3 lines under alkaline stress

堿脅迫下東農(nóng)425的根數(shù)、根長(zhǎng)和葉綠素含量相對(duì)堿害率分別為33.1%、47.2%和54.4%，而長(zhǎng)白10號(hào)的根數(shù)、根長(zhǎng)和葉綠素含量相對(duì)堿害率分別為11.7%、42.7%和27.1%。說(shuō)明東農(nóng)425的耐堿性明顯弱于長(zhǎng)白10號(hào)，在幼苗前期，兩個(gè)親本間耐堿性的差異明顯。

F2∶3家系群在自然條件下的根數(shù)、根長(zhǎng)和葉綠素含量平均值分別為10.30條、10.78 cm和22.86 mg·g-1，而堿脅迫下F2∶3家系群的根數(shù)、根長(zhǎng)和葉綠素含量平均值分別為9.08條、8.84 cm和16.64 mg·g-1。自然條件下F2∶3家系群體的根數(shù)、根長(zhǎng)和葉綠素含量變異范圍分別為6.67～14.67條、4.26～19.90 cm和9.03～29.33 mg·g-1，而堿脅迫下F2∶3家系的根數(shù)、根長(zhǎng)和葉綠素含量變異范圍分別為5.30～13.30 條、2.80～16.84 cm和 3.10～27.26 mg·g-1。以上說(shuō)明，堿脅迫明顯阻礙幼苗前期的水稻生長(zhǎng)，并且F2∶3代群體的根數(shù)、根長(zhǎng)和葉綠素含量及其相對(duì)堿害率之間的差異較為明顯。

堿脅迫條件下，F(xiàn)3家系的根數(shù)、根長(zhǎng)、葉綠素含量及所對(duì)應(yīng)的相對(duì)堿害率分布見(jiàn)圖1。從圖1中可以看出，這三個(gè)性狀及所對(duì)應(yīng)的相對(duì)堿害率均呈單峰連續(xù)分布，其平均值都介于雙親之間。通過(guò)正態(tài)分布的適合性檢驗(yàn)，并且發(fā)現(xiàn)其峰度和偏度的絕對(duì)值都小于1，表明所有性狀的表型值基本符合正態(tài)分布，呈現(xiàn)典型的數(shù)量性狀遺傳模式，適合QTL定位。

2.2 幼苗前期水稻耐堿性的QTL檢測(cè)

2.2.1 根數(shù)

堿脅迫下，檢測(cè)到與根數(shù)相關(guān)的QTLs 3個(gè)，處于第1和第6條染色體上（見(jiàn)表2和圖2），其LOD值范圍為2.65～3.22，表型變異的解釋率范圍為6.59%～13.48%。在第1染色體RM529～RM302區(qū)間的qRN1-2對(duì)表型變異的解釋率比較大為13.48%，其增效等位基因來(lái)自于長(zhǎng)白10號(hào)，另外2個(gè)QTLs的貢獻(xiàn)率比較小，分別為7.25%和6.59%。

在第10染色體上只檢測(cè)到1個(gè)與根數(shù)相對(duì)堿害率有關(guān)的QTL，LOD值為2.75，能解釋表型變異的14.49%，是主效QTL，其增效等位基因來(lái)自東農(nóng)425。

表2 堿脅迫下水稻幼苗前期相關(guān)性狀的QTL及其遺傳效應(yīng)Table 2 QTL and their genetic effects for some agronomic traits at early seedling period in rice under alkaline stress

圖2 堿脅迫下水稻幼苗前期根數(shù)、根長(zhǎng)和葉綠素含量及其相對(duì)堿害率的QTL區(qū)間分布圖Fig.2 Intervals distribution of QTLs for root number,root length,chlorophyll content,and their relative alkaline damage rates at early seedling stage under alkaline stress

2.2.2 根長(zhǎng)

在堿脅迫下，定位出與根長(zhǎng)相關(guān)的2個(gè)QTLs，分別位于第7和第8染色體上，其LOD值為2.58和2.57，分別能解釋表型變異的9.61%和21.84%。其中第8染色體上RM1384～RM1235區(qū)間的qRL8對(duì)表型變異的解釋率比較大為21.84%，是主效QTL。qRL7和qRL8的增效等位基因均來(lái)自東農(nóng)425。

堿脅迫下，與根長(zhǎng)相對(duì)堿害率相關(guān)的QTLs檢測(cè)到2個(gè)，在第8和第11染色體上，其LOD值分別為4.73和2.86，分別能解釋表型變異的19.94%和9.26%。位于RM1384～RM1235區(qū)間的qRRL8具有較大解釋率，為19.94%，是主效QTL。qRRL8的增效等位基因來(lái)自長(zhǎng)白10號(hào)，而qRRL11的增效等位基因來(lái)自東農(nóng)425。

2.2.3 葉綠素含量

在堿脅迫條件下，檢測(cè)到2個(gè)與葉綠素含量相關(guān)的QTLs，分別位于第3和第6染色體上，其LOD值為4.47和3.31，對(duì)表型變異的解釋率分別為16.21%和8.64%，其中qCC-3的增效等位基因來(lái)自東農(nóng)425，qCC6的增效等位基因來(lái)自長(zhǎng)白10號(hào)。

在堿脅迫條件下，檢測(cè)到6個(gè)與葉綠素含量相對(duì)堿害率相關(guān)的QTLs，分別位于第1、3、6、9、10和12染色體上，其LOD值范圍為2.57～5.40，對(duì)表型變異的解釋率范圍為7.54%～21.51%。其中位于第1染色體RM529～RM1321區(qū)間的qCC1和位于第9染色體RM201～RM285區(qū)間的qCC9能較大地解釋表型變異，分別為21.51%和17.15%，為主效QTL。qRCC1、qRCC3、qRCC9和qRCC10增效等位基因來(lái)自長(zhǎng)白10號(hào)，而其余QTL增效等位基因則來(lái)自東農(nóng)425。

3 討論

3.1 水稻耐鹽堿性遺傳

前人研究認(rèn)為，水稻耐鹽堿性是受多基因控制的數(shù)量性狀，是水稻受鹽堿脅迫時(shí)各種生理反應(yīng)的綜合表現(xiàn)[6]。祁祖白等研究認(rèn)為，環(huán)境會(huì)影響水稻苗期的耐鹽性，若環(huán)境不適會(huì)導(dǎo)致其遺傳力相對(duì)較低[7]。賀道耀等研究指出，鹽脅迫下脯胺酸含量較高的水稻變異體其耐鹽性具有可遺傳性[8]。有研究指出，水稻在苗期的耐鹽性比較穩(wěn)定，主要遺傳基礎(chǔ)就是基因加性效應(yīng)，在雜交的后代家系群體中水稻耐鹽性升高是親本同時(shí)作用的結(jié)果，苗期與成熟期遺傳基礎(chǔ)是共同的[9]。楊慶利等利用模型（主位點(diǎn)組加性-顯性）分別對(duì)7個(gè)水稻品種苗期的耐鹽性遺傳機(jī)制進(jìn)行研究[10]，結(jié)果可知，在鹽脅迫條件下水稻苗期根系中Na+/K+吸收比率的遺傳受2個(gè)主效QTLs和微效QTLs的控制，鹽害級(jí)別的遺傳受3個(gè)主效QTLs和微效QTLs控制，顯性效應(yīng)和加性效應(yīng)的共同作用控制水稻苗期根系中Na+/K+吸收比和鹽害級(jí)別的遺傳。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在濃度25 mmol·L-1NaHCO3堿溶液脅迫下F2∶3家系的根長(zhǎng)、根數(shù)和葉綠素含量及其相對(duì)堿害率均呈正態(tài)連續(xù)分布，可知堿脅迫下水稻以上性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀。

3.2 水稻耐堿性QTL定位

當(dāng)前分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為闡明QTL性狀遺傳基礎(chǔ)提供依據(jù)。目前，有關(guān)Na+和K+的吸收量的比率[11]，成熟期的莖葉干鮮重比率、穗長(zhǎng)、株高及空癟率[9]，單株活力指數(shù)等耐鹽性的QTL檢測(cè)報(bào)道諸多，多數(shù)是關(guān)于水稻耐鹽性的報(bào)道，而對(duì)水稻耐堿性的研究報(bào)道甚少。祈?xiàng)濎`等利用F2∶3群體在堿脅迫下共檢測(cè)到7個(gè)與水稻發(fā)芽率有關(guān)的QTLs以及6個(gè)與水稻發(fā)芽率相對(duì)堿害率有關(guān)的QTLs[11]。

本研究檢測(cè)到的與葉綠素含量相對(duì)堿害率有關(guān)的QTL與祈?xiàng)濎`等[11]檢測(cè)到的與發(fā)芽率相對(duì)堿害率有關(guān)的QTL均定位在第9和12條染色體上，且位于相同區(qū)間，說(shuō)明這2個(gè)QTLs同時(shí)控制著水稻發(fā)芽期和幼苗前期的耐堿性，另外祈?xiàng)濎`等對(duì)幼苗前期的根數(shù)、根長(zhǎng)、苗高以及相對(duì)堿害率進(jìn)行QTL檢測(cè)，本研究結(jié)果與其相比較存在較大共性[12]，本研究所檢測(cè)到的與葉綠素含量相對(duì)堿害率有關(guān)的QTL與祈?xiàng)濎`等[12]檢測(cè)到的與苗高相對(duì)堿害率有關(guān)的QTL均與RM1340相連鎖，且與程海濤等[13]檢測(cè)到的控制水稻相對(duì)苗高的QTL位于同一區(qū)間，說(shuō)明這個(gè)QTL與水稻幼苗期的耐堿性相關(guān)的可能性極大，同時(shí)也可以看出，以葉綠素含量相對(duì)堿害率為指標(biāo)進(jìn)行水稻幼苗前期耐堿性QTL定位時(shí)，與前人有很大的一致性，可考慮將葉綠素含量相對(duì)堿害率作為評(píng)價(jià)水稻幼苗期耐堿性的直接指標(biāo)。本研究與祈?xiàng)濎`[12]等都將控制根數(shù)和根數(shù)相對(duì)堿害率的QTL定位在第6條染色體上，并且都將與根長(zhǎng)有關(guān)的QTL定位在第8條染色體上，具有高度一致性，但由于采用標(biāo)記不同，不能確定是否為同一區(qū)間。因此，QTL定位需要更廣泛的研究，力求找到不同遺傳材料和環(huán)境條件下都能出現(xiàn)的QTL。

將本研究所定位的QTL比較可知，qRN6與qRCC6均位于第6條染色體的RM1340-RM454區(qū)間，qRL8與qRRL8均位于第8條染色體的RM1384-RM1235區(qū)間，qCC3與qRCC3第3條染色體的RM293-RM1352區(qū)間。以上這些QTLs都位于染色體的相同區(qū)間，說(shuō)明在堿脅迫下，上述QTL雖位于同一標(biāo)記區(qū)間，卻控制不同性狀，這與程海濤等的試驗(yàn)研究結(jié)果[13]相似。程海濤等對(duì)水稻發(fā)芽期和水稻幼苗前期在堿脅迫下的耐堿性進(jìn)行QTL檢測(cè)結(jié)果表明[13]，qRGR1和qRGI1都在第1染色體CT550～CT158區(qū)間；qADS3和qRRL3-1同處在第3染色體上的CT339～CT62區(qū)間。這些QTL位于同一區(qū)間卻分別控制不同性狀，說(shuō)明它們有可能為同一QTL，一因多效，或者是它們之間為相近的緊密相連鎖的，其部分區(qū)域發(fā)生重疊，各性狀間的相關(guān)性與這一特性有關(guān)，有待深入研究。

4 結(jié)論

在堿脅迫條件下水稻幼苗前期的根數(shù)、根長(zhǎng)和葉綠素含量及其相對(duì)堿害率呈連續(xù)的正態(tài)分布，認(rèn)為是由主效基因和微效基因共同控制的數(shù)量性狀。其中qRN1-2、qRRN10、qRL8、qRRL8、qCC3、qRCC1、qRCC3和qRCC9對(duì)表型變異的解釋率較大，分別為13.48%、14.99%、21.84%、19.94%、16.21%、21.51%、13.95%和17.15%，為主效QTL。

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