高 媛，鄭文嶺，馬文麗

(南方醫(yī)科大學基因工程研究所，廣東廣州510515)

基因診斷徹底打破了常規(guī)診斷方式，不再以疾病的表型為主要依據(jù)推測疾病的發(fā)生及機制，而是采用分子生物學和分子遺傳學方法，直接檢測被檢者某一特定基因的結(jié)構(gòu)或者功能是否異常，從而對相應的疾病進行診斷。相對于常規(guī)診斷，基因診斷更注重個體基因狀態(tài)，不僅可以對患者所患疾病做出判斷，也可以對表型正常但攜帶有某種特定疾病基因或者特定疾病的易感者做出預測［1-2］。隨著分子生物學和分子遺傳學的快速發(fā)展，更先進、更成熟的基因診斷技術(shù)不斷涌現(xiàn)，本文將基因診斷中常用的分子生物學技術(shù)及其在臨床中的應用做一綜述。

1 分子雜交技術(shù)及相關(guān)技術(shù)

分子雜交技術(shù)包括Southern雜交、Northern雜交、Dot雜交和Western雜交。該技術(shù)主要有3個步驟:核酸的分離與純化、探針的制備和分子雜交。Southern雜交、Northern雜交和Dot雜交也稱核酸的分子雜交，用于檢測特定的DNA、RNA，其基本原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈在適宜的溫度和離子強度下，根據(jù)堿基互補配對原則退火時形成穩(wěn)定的異源雙鏈。以已知核酸片段作為探針并加以標記，雜交過程高度特異。Western雜交又稱免疫學測定，用于檢測特定的蛋白質(zhì)，其基本原理是利用單克隆或者多克隆抗體，通過抗原抗體反應檢測蛋白質(zhì)。目前，在分子雜交技術(shù)基礎(chǔ)上形成多種新的技術(shù)，如熒光原位雜交(FISH)、多色熒光原位雜交(MFISH)、比較基因組雜交(CGH)等。臨床中常用雜交技術(shù)診斷遺傳病、癌癥、感染性疾病等，比如鐮刀型細胞貧血癥、苯丙酮尿癥(PKU)、β地中海貧血、結(jié)核分枝桿菌檢測等。目前已有商業(yè)性核酸探針試劑盒用于臨床鑒定一些重要的分枝桿菌。另外值得一提的是熒光原位雜交技術(shù)廣泛用于檢測染色體重組和標記染色體，檢測多種基因疾病的染色體微缺失和非整倍體疾病的產(chǎn)前診斷，同時在血液學領(lǐng)域中熒光原位雜交技術(shù)也得到越來越廣泛的應用，尤其是在白血病診斷、治療、監(jiān)測、預后評估和微小殘留病檢測等方面成為不可缺少的重要手段。

2 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)及相關(guān)技術(shù)

PCR基本原理是雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。在PCR基礎(chǔ)上，已經(jīng)發(fā)展了包括多重PCR、多重巢式PCR、實時熒光定量PCR(RQ-PCR)、PCR直接分析法(DA)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)、序列特異引物PCR(PCR-SSP)、PCR寡核苷酸探針雜交(PCR-SSO)和PCR產(chǎn)物直接測序分型(PCRSBT)等多種PCR衍生技術(shù)。RQ-PCR具有靈敏、特異、技術(shù)成熟和操作簡便等優(yōu)點，對于臨床上明確診斷、具體分型、動態(tài)觀測腫瘤負荷、選擇合適治療方案、評估治療效果和預后都有較大價值［3］。除了作為艾滋病療效觀察的有效檢測手段外，RQ-PCR技術(shù)常用于檢測白血病融合基因，結(jié)果準確、穩(wěn)定。此外，該技術(shù)在產(chǎn)前監(jiān)測和產(chǎn)前基因診斷也具有重要意義，比如β地中海貧血癥。目前對遺傳性物質(zhì)改變引起的疾病還無法進行根治，只能通過產(chǎn)前監(jiān)測和產(chǎn)前基因診斷，減少病嬰的出生。RQ-PCR可以對患者β與γ珠蛋白mRNA水平進行特異、定量、準確的檢測，有效地檢出病嬰。PCR直接分析法常用于α-地中海貧血癥、Barts胎兒水腫綜合征、肌營養(yǎng)不良癥(DMD)等疾病的快速診斷。另外，在我國相當一部分單位，也有應用PCR-SSCP、PCR-DGGE和多重PCR技術(shù)對G-6-PD缺乏癥、乙型肝炎病毒、β地中海貧血癥、苯丙酮尿癥(PKU)、杜氏肌營養(yǎng)不良癥(DMD)進行臨床病例的診斷［4］。

3 免疫組織化學技術(shù)和免疫細胞化學技術(shù)

免疫組織化學和免疫細胞化學技術(shù)都是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合反應來鑒定組織或細胞中特定化學物質(zhì)的化學方法，具有較高的敏感性和特異性。免疫組織化學技術(shù)可在組織切片、細胞涂片上進行蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)的定位、定性和定量，是研究和觀察細胞中某些結(jié)構(gòu)或分子物質(zhì)及組織細胞間成分的主要手段，已成為病理學科中不可缺少的技術(shù)支持。免疫細胞化學在鑒定上皮性、間葉性或淋巴性腫瘤方面以及淋巴瘤亞型分類中發(fā)揮著重要作用。臨床中常采用這種技術(shù)進行穿刺、破碎或微量標本的確診、轉(zhuǎn)移性腫瘤的原發(fā)病灶的確定、惡性淋巴瘤的診斷和分類、確定腫瘤的分化程度、腫瘤細胞增生程度的評價以及雌孕激素受體的檢測等等。該技術(shù)不僅提高病理診斷的準確性，對腫瘤和其他疾病的治療也具有十分積極的意義。比如D2-40是一種與生殖細胞腫瘤和胎兒睪丸精原細胞相關(guān)的唾液酸糖蛋白，常用來標記淋巴管的內(nèi)皮細胞，因間皮細胞表達D2-40，故可采用免疫化學對惡性間皮瘤與癌進行鑒別。Campos等［5］采用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)生長因子受體(TrkA)在卵巢癌中的表達高于正常卵巢，推測TrkA和神經(jīng)生長因子(NGF)可以作為卵巢癌靶向治療的靶點。

4 基因芯片技術(shù)

基因芯片是通過微量點樣技術(shù)等方法，把大量基因的cDNA作為探針固定于支持物即載體玻片上(通常支持物上的一個點代表一種分子探針)，提取待測組織的mRNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA，經(jīng)熒光標記，與載體玻片上探針進行雜交，雜交信號通過基因芯片掃描儀收集，由特定的分析軟件進行分析，從而對基因序列及其功能進行大規(guī)模高通量的研究?；蛐酒\斷技術(shù)具備快速、高效、敏感、平行化和自動化等特點，能快速、準確地從分子水平診斷疾病。基因芯片的出現(xiàn)，使得高通量集成化的分析成為可能。應用基因芯片在臨床醫(yī)學中進行研究目前已經(jīng)取得初步進展。比如:1)疾病臨床早期診斷和批量篩選。將疾病的特異性基因片段或致病病原體的基因片段固定于芯片上，可制成疾病診斷芯片。提取患者樣本中的核酸進行標記作為探針，利用探針與芯片雜交，掃描雜交結(jié)果，可分析得到該例患者是否患有此類疾病，這就是臨床檢驗芯片原理。目前，肝炎的診斷、地中海貧血病的篩選、性病的批量檢測等等，都有相應的基因芯片的開發(fā)和應用。2)確定疾病亞型和選擇最佳治療方案。在芯片上固定同一種疾病不同類型的特征性基因，我們可以得到某種疾病的分型基因芯片。由于同種疾病的各個亞型在臨床表現(xiàn)上非常相似，僅依靠臨床癥狀往往難以區(qū)分，正確地分析亞型對于疾病的治療以及預后情況分析具有十分重要的指導作用［6］。3)耐藥基因的篩選以及新藥的研發(fā)。如果長時間使用同一種藥物，病原體會對該藥物產(chǎn)生耐受性，進而影響療效。因此，我們需要在鑒定分離耐藥基因的同時開發(fā)新的有效藥物。利用基因芯片技術(shù)，我們不僅可以找出疾病特異性相關(guān)的致病基因，并且可以通過研究相應的抑制藥物，觀察細胞或者機體用藥之后的反應，從而為新藥的研發(fā)開辟一條新的路徑。乙型肝炎病毒耐藥芯片是目前較為成熟的臨床檢驗芯片。已有的研究表明，通過耐藥芯片的實時監(jiān)測，檢測患者血液中的病毒突變情況，在耐藥性即將產(chǎn)生時，改變治療策略，可以得到很好的治療效果。因此基因芯片可以有效地輔助臨床治療方法。

5 新一代基因測序技術(shù)

新一代基因測序技術(shù)提供了一種和基因芯片技術(shù)互為補充的新的高通量工具，通常新一代基因測序技術(shù)指的是一個技術(shù)群，不同的新一代基因測序技術(shù)，在原理上存在較大的差別。目前，已經(jīng)市場化或者接近市場化的基因測序技術(shù)主要有3種，分別是Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)。這3種測序技術(shù)雖然不同于傳統(tǒng)的基因測序技術(shù)，但是他們都有一個共同之處:均使用反應信號的實時閱讀，在測序反應進行的同時收集反應信號，因此測序成本可以大幅度消減。新一代測序技術(shù)除了在科研領(lǐng)域(比如通過檢測人類基因組上基因拷貝數(shù)變異、基因缺失研究人類基因的多態(tài)性等)應用廣泛外，在臨床醫(yī)學也有著廣闊的應用前景。比如:1)遺傳病的診斷。White等［7］建立了針對 Angelman綜合征和 Prader-Willi綜合征SRNPN基因甲基化檢測平臺，診斷率達到100%。2)傳染性疾病的快速診斷。采用該技術(shù)可以有效地預防在國內(nèi)曾經(jīng)爆發(fā)的甲型H1N1流感和SARS等傳染疾病，避免疾病的大規(guī)模爆發(fā)流行，也為較短時間內(nèi)制定疫情防控策略提供科學依據(jù)和堅實保障。3)個體化醫(yī)療。新一代基因測序技術(shù)的出現(xiàn)急速降低了基因測序的成本。將來類似人類基因組規(guī)模的測序，預計僅1 000美元就可以完成。目前，臨床醫(yī)學已進入從群體治療向個體化醫(yī)療轉(zhuǎn)變時期，越來越多的疾病根據(jù)個體的遺傳學信息制定針對性的預防疾病措施和治療方案，譬如腫瘤的靶向治療。

6 基因診斷的前景與挑戰(zhàn)

隨著科研人員對疾病發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制的深入研究，以及“人類基因組計劃”的順利實施，人們越來越清晰地認識到基因與疾病的關(guān)系。目前，科研人員更多地關(guān)注如何發(fā)展和利用基因檢測技術(shù)找尋致病基因、解碼個體基因、評估患病風險，進而對個體進行基因診斷與治療;因此，基因檢測、診斷技術(shù)迅速崛起，逐漸改變現(xiàn)有的醫(yī)療模式［8］。在基因診斷逐漸興盛的同時，由于不能準確地評估患病風險，以及對一些可以檢測的致病基因所引發(fā)的疾病沒有有效的預防和治療措施，基因檢測結(jié)果反而成為思想負擔。盡管基因診斷技術(shù)存在以上缺陷，但這些問題都無法抹殺該項技術(shù)對人類健康所做的貢獻。相信隨著醫(yī)學技術(shù)的不斷發(fā)展，憑借人體基因密碼預測相關(guān)疾病的風險性，做到早檢測、早預防、早治療，基因診斷技術(shù)在臨床的應用會有一個更加廣闊的前景。

［1］Zechi-Ceide RM，Jesus-Oliveira NA，Guion-Almeida ML，et al.Clinical evaluation and COL2A1 gene analysis in 21 Brazilian families with Stickler syndrome:identification of novel mutations，further genotype/phenotype correlation，and its implications for the diagnosis［J］.Eur J Med Genet，2008，51:183-196.

［2］府偉靈.基因診斷治療與預測醫(yī)學［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2009，31:24-25.

［3］Mikael KA，Jose MA，Martin B，et al.The real-time polymerase chain reaction［J］.Mol Aspects Med，2006，27:95-125

［4］朱平.利用PCR衍生技術(shù)檢測血液系統(tǒng)疾?。跩］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2009，32:6-9.

［5］Campos X，Mu?oz Y，Selman A，et al.Nerve growth factor and its high-affinity receptor trkA participate in the control of vascular endothelial growth factor expression in epithelial ovarian cancer［J］.Gynecol Oncol，2007，104:168-175.

［6］任莉莉，李富榮，戴勇.基因芯片技術(shù)在臨床醫(yī)學研究中的應用［J］.現(xiàn)代診斷與治療，2002，13:159-160.

［7］White HE，Durston VJ，Harvey JF，et al.Quantitative analysis of SNRPN(correction of SRNPN)gene methylation by pyrosequencing as a diagnostic test for Prader-Willi syndrome and Angelman syndrome［J］.Clin Chem，2006，52:1005-1013.

［8］Silver JN，F(xiàn)lotte TR.Towards a rAAV2 based gene therapy for ADA2 SCID:from ADA deficiency to current and future treatment strategies［J］.Pharmacogenomics，2008，9:947-968.