宋 群 ， 劉春鳳 ， 李永仙 ， 王金晶 ， 李 崎 *

（1.江南大學(xué) 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

純生啤酒摒棄了傳統(tǒng)的熱殺菌工藝，因此避免了加熱對(duì)啤酒風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)造成的破壞，由于其良好的口感和較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，越來越受到市場(chǎng)的歡迎。但是，目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的純生啤酒泡沫穩(wěn)定性普遍較差，嚴(yán)重影響了純生啤酒的質(zhì)量，成為制約純生啤酒發(fā)展的重要因素[1-4]。研究證實(shí)，在啤酒釀造過程中，酵母分泌的蛋白酶A是影響啤酒泡沫穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素[5-9]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酵母自溶時(shí)蛋白酶A會(huì)被釋放到胞外；同時(shí)，在營(yíng)養(yǎng)物缺乏等惡劣環(huán)境下，酵母蛋白酶分選因子失效，蛋白酶A通過缺省途徑運(yùn)輸?shù)桨鈁6，10]。由于純生啤酒未經(jīng)過加熱處理，在貨架期內(nèi)，被分泌到胞外的蛋白酶A會(huì)不斷降解啤酒中的泡沫活性蛋白，從而對(duì)純生啤酒的泡沫穩(wěn)定性造成嚴(yán)重影響。隨著“純生熱”的不斷升溫，如何降低酵母分泌的蛋白酶A對(duì)啤酒泡沫產(chǎn)生的負(fù)面影響引起越來越多研究者的關(guān)注。Slaughter[12]等認(rèn)為無顯著抑制劑存在時(shí)，發(fā)酵期間蛋白酶A活力下降，Omrod[12]、Muldbjerg發(fā)現(xiàn)在冷貯期蛋白酶A分泌較多。Kondo[14]發(fā)現(xiàn)三倍體和多倍體酵母菌株比單倍體和二倍體酵母菌株的蛋白酶A分泌量多；酵母細(xì)胞內(nèi)pH不同，蛋白酶A分泌量也不同，pH越高，蛋白酶A分泌量越低；酵母貯存時(shí)間越長(zhǎng)，貯存溫度越高，后酵過程中酵母活力越低，蛋白酶A分泌量越多；在低氮條件下，蛋白酶A的分泌量多于氮源充足時(shí)的分泌量。

作者從菌種、酵母生理狀態(tài)、酵母代數(shù)、麥汁濃度、發(fā)酵過程等方面研究了在發(fā)酵過程中影響蛋白酶A分泌的因素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋白酶A分泌量高的菌株，處于穩(wěn)定期之后的酵母、較高的酵母代數(shù)、較高的原麥汁濃度和在發(fā)酵階段末期都會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中蛋白酶A活性偏高，在實(shí)際生產(chǎn)中可根據(jù)以上結(jié)論做出相應(yīng)調(diào)整，從而減少蛋白酶A分泌，提高純生啤酒泡沫穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酵母菌株:G-03（F25）、D-4、C-03、青②（F15）、Q-05A、J-1為作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏；干酪素、三氯乙酸、甘氨酸、NaOH、HCl等均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

熒光分光光度計(jì)（650-60）:日本 HITACHI公司；單光束紫外/可見分光光度計(jì)（UV1102）:上海天美科學(xué)儀器有限公司；精密pH計(jì)（FE20）:梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母擴(kuò)培及啤酒發(fā)酵 從斜面上挑取一環(huán)酵母細(xì)胞接種到裝有10 mL麥汁的試管中，25℃培養(yǎng)36 h。取1 mL上述發(fā)酵液接種到裝有9 mL麥汁的試管中，25℃培養(yǎng)36 h。將試管中的10 mL發(fā)酵液全部轉(zhuǎn)移到裝有70 mL的250 mL三角瓶中，28℃、150 r/m，搖瓶培養(yǎng)24 h。將三角瓶在4℃下放置12 h，使酵母泥沉降。將酵母泥接種到裝有300 mL麥汁的500 mL三角瓶中，裝上發(fā)酵栓，11℃發(fā)酵6 d。

1.2.2 主要試劑的配制

1）酪蛋白溶液（0.1%）:0.25 g酪蛋白用60 mL、6 mol/L HCl加熱、超聲溶解，加Gly-HCl緩沖液，使其終濃度為0.1 mol/L，用飽和NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 3，用蒸餾水定容到250 mL，中速濾紙過濾。

2）TCA 溶液（2.5 mol/L）:稱取 408.48 g 三氯乙酸溶于蒸餾水，定容至1 L，過濾。

1.2.3 蛋白酶A酶活測(cè)定方法 將發(fā)酵液離心，取上清液即為粗酶液。在10 mL小試管中加入0.1 mL粗酶液，再加入0.1%酪蛋白溶液1 mL，混勻，40℃反應(yīng) 20 min，加入 2 mL、2.5 mol/L TCA，加蒸餾水將體系體積補(bǔ)齊到5 mL，混勻，室溫締合20 min?？瞻诪樵诿敢褐邢燃? mL、2.5 mol/L的TCA中止反應(yīng)20 min后，再加入酪蛋白溶液。設(shè)定熒光分光光度計(jì)的發(fā)射光和激發(fā)光波長(zhǎng)均為468 nm，狹縫均為2 nm，分別測(cè)定反應(yīng)體系的共振散射光強(qiáng)度I4468反應(yīng)和空白體系的共振散射光強(qiáng)度I4468空白。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種對(duì)蛋白酶A分泌的影響

首先考察了不同酵母菌種對(duì)啤酒釀造過程中蛋白酶A分泌的影響。分別使用實(shí)驗(yàn)室保藏的6株生產(chǎn)用菌株在1.2.1實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液中蛋白酶A的活性，結(jié)果見圖1。

如圖1所示，酵母菌株D-4和Q-05A的發(fā)酵液中檢測(cè)不到蛋白酶A活性，酵母青②（F15）和J-1的發(fā)酵液中蛋白酶A活性略低，其△I468分別為42和20，而酵母G-03（F25）和 C-03的發(fā)酵液中可以檢測(cè)到較高的蛋白酶A活性，其△I468分別為108和100。因此，不同酵母菌種蛋白酶A的分泌量不同，最終使得發(fā)酵液中蛋白酶A的活性有很大差異。酵母菌種是蛋白酶A產(chǎn)生的惟一來源，菌種的差異必然會(huì)帶來蛋白酶A分泌量的差異。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中選擇蛋白酶A分泌量低的菌株進(jìn)行發(fā)酵，會(huì)對(duì)降低發(fā)酵液及成品啤酒中蛋白酶A活性起到積極作用。

圖1 不同菌種發(fā)酵啤酒時(shí)發(fā)酵液中蛋白酶A活性Fig.1 Proteinase A activity of different strain’s fermentation broths

2.2 酵母生理狀態(tài)對(duì)蛋白酶A分泌的影響

為了考察酵母生理狀態(tài)對(duì)蛋白酶A分泌的影響，實(shí)驗(yàn)選用酵母菌株G-03（F25）為研究對(duì)象，測(cè)定了其細(xì)胞濃度曲線和死亡率曲線，見圖2。在得到的曲線上選取7個(gè)時(shí)期，時(shí)期1:延遲期（2 h）、時(shí)期2:對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期（6 h）、時(shí)期3:對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期（14 h）、時(shí)期 4:穩(wěn)定期初期（18 h）、時(shí)期 5:穩(wěn)定期中期（28 h）、時(shí)期 6:穩(wěn)定期末期（38 h）、時(shí)期 7:衰亡期（48 h）。分別測(cè)定處于這7個(gè)時(shí)期的酵母分泌的蛋白酶A活性，見圖3。

圖2 菌株G-03（F25）細(xì)胞濃度及死亡率曲線Fig.2 Cell concentration and the mortality curves of G-03（ F25）

圖3 不同生理狀態(tài)酵母分泌的蛋白酶A活性Fig.3 Activity of proteinase A secreted by yeast of different physiological state

由圖2和圖3可以看出，不同生理狀態(tài)下酵母產(chǎn)生的蛋白酶A活性不同。處于延遲期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的酵母不產(chǎn)生蛋白酶A，而從穩(wěn)定期開始可以檢測(cè)到蛋白酶A活性（△I468=426），并且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白酶A活性逐漸增強(qiáng)，至衰亡期時(shí)蛋白酶A活性高達(dá)1 179，為穩(wěn)定期初期時(shí)蛋白酶A活性的2.7倍。因此，生產(chǎn)中接種穩(wěn)定期以前的酵母進(jìn)行發(fā)酵將會(huì)有效降低發(fā)酵液中蛋白酶A活性。

2.3 酵母代數(shù)對(duì)蛋白酶A分泌的影響

在實(shí)際的啤酒生產(chǎn)中，啤酒酵母通常會(huì)使用3～5代，為了考察不同傳代次數(shù)酵母分泌蛋白酶A的情況，在實(shí)驗(yàn)室下中參照1.2.1實(shí)驗(yàn)條件跟蹤測(cè)定了同一酵母菌株G-03（F25）的 0～5代發(fā)酵液中蛋白酶A的活性，結(jié)果見圖4。

圖4 同種酵母不同代數(shù)發(fā)酵液的蛋白酶A活性Fig.4 Proteinase A activity of different generation yeast’s fermentation broths

從圖4中可以看出，不同代數(shù)酵母的發(fā)酵液蛋白酶A活性不同，0～3代酵母的發(fā)酵液檢測(cè)不到蛋白酶A活性，而4代、5代酵母的發(fā)酵液可以檢測(cè)到蛋白酶A活性，其△I468分別為70和98。因此，酵母代數(shù)的增加將會(huì)導(dǎo)致蛋白酶A分泌量的增加。在生產(chǎn)中，使用較小代數(shù)的酵母，尤其是三代以內(nèi)的酵母進(jìn)行啤酒發(fā)酵可以降低蛋白酶A的分泌量。

2.4 原麥汁濃度對(duì)蛋白酶A分泌的影響

傳統(tǒng)啤酒釀造采用12°P麥汁發(fā)酵，但為了提高啤酒產(chǎn)量和設(shè)備利用率，目前，啤酒廠多使用高濃釀造技術(shù)。高濃釀造技術(shù)即采用高濃度麥汁糖化和發(fā)酵，啤酒成熟后，再用無菌水稀釋成不同濃度的啤酒。為了考察高濃釀造對(duì)蛋白酶A分泌的影響，在實(shí)驗(yàn)室條件下測(cè)定了使用不同濃度麥汁發(fā)酵時(shí)的蛋白酶A活性，并將結(jié)果折算成12°P麥汁的數(shù)值，見圖5。

圖5 不同濃度麥汁發(fā)酵時(shí)的蛋白酶A活性Fig.5 Proteinase A activity of different concentration worts’fermentation broths

如圖5所示，使用12、14、16°P的麥汁發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵液無蛋白酶A活性，當(dāng)麥汁濃度為18°P時(shí)，在發(fā)酵液中可以檢測(cè)到蛋白酶A活性，△I468=15，當(dāng)麥汁濃度為20°P時(shí)，△I468=112，當(dāng)麥汁濃度為22°P時(shí)，△I468=110。因此，發(fā)酵時(shí)的麥汁濃度會(huì)對(duì)蛋白酶A的分泌產(chǎn)生影響，高濃度的麥汁，會(huì)迫使酵母分泌更多的蛋白酶A。在實(shí)際生產(chǎn)中，采用18°P以下的麥汁進(jìn)行發(fā)酵，可以減少酵母蛋白酶A的分泌量。

2.5 發(fā)酵過程中蛋白酶A分泌情況

為了考察在實(shí)際的發(fā)酵過程中蛋白酶A的分泌情況，實(shí)驗(yàn)中跟蹤了1 000 L大罐啤酒發(fā)酵過程中蛋白酶A的活性變化，結(jié)果見圖6。

圖6 啤酒發(fā)酵過程中蛋白酶A活性Fig.6 Proteinase A activity in beer fermentation process

從圖6可以看出，在發(fā)酵的前8天發(fā)酵液中沒有蛋白酶A活性，在發(fā)酵的第9天、第10天可以檢測(cè)到蛋白酶A活性，△I468分別為11和21?？梢钥闯?，酵母在啤酒發(fā)酵初期基本不分泌蛋白酶A，在發(fā)酵末期逐漸開始分泌蛋白酶A。在發(fā)酵初期，酵母的營(yíng)養(yǎng)物充足，生存條件優(yōu)越，蛋白酶A的產(chǎn)生量較低，但是，隨著營(yíng)養(yǎng)物的消耗，酒精濃度上升，二氧化碳濃度上升等條件的變化，酵母的生存環(huán)境逐漸惡劣，導(dǎo)致了酵母分泌的蛋白酶A增加。因此，啤酒釀造過程中盡早結(jié)束發(fā)酵可以降低發(fā)酵液蛋白酶A活性。

3 結(jié)語

在啤酒發(fā)酵過程中有較多因素會(huì)影響酵母蛋白酶A的分泌。菌種的不同會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中蛋白酶A的活性有很大差異，因此，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)選擇蛋白酶A分泌量低的菌株進(jìn)行發(fā)酵。處于穩(wěn)定期以后的酵母分泌的蛋白酶A量顯著增加，生產(chǎn)中可以選擇處于此階段之前的酵母進(jìn)行生產(chǎn)。較高的酵母代數(shù)，會(huì)使發(fā)酵液中蛋白酶A活性偏高，在生產(chǎn)中，應(yīng)使用三代以內(nèi)的酵母進(jìn)行啤酒發(fā)酵。原麥汁濃度增加，會(huì)迫使酵母分泌更多的蛋白酶A，在實(shí)際生產(chǎn)中，可以采用18°P以下的麥汁進(jìn)行發(fā)酵。在啤酒發(fā)酵過程中，酵母在發(fā)酵初期不分泌蛋白酶A，在發(fā)酵末期分泌量逐漸增加，因此，啤酒釀造過程中盡早結(jié)束發(fā)酵可以有效降低發(fā)酵液中蛋白酶A活性。

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