段 暉， 秦玉梅， 熊藝姣， 郭會(huì)林， 鄧少平

（浙江工商大學(xué) 食品學(xué)院，浙江 杭州310012）

味覺作為人類食物辨別、選擇及接受決定因素之一，用于食物及飲品中營(yíng)養(yǎng)及有害物質(zhì)的檢測(cè)，引起應(yīng)急反應(yīng)，導(dǎo)致食物的接受與回避，是人類不可或缺的生理功能。一旦味覺的感知能力顯著下降，將會(huì)導(dǎo)致人類的飲食偏好及食物攝入變化，從而最終影響人類的代謝并引發(fā)健康問題。近年來，糖尿病的發(fā)病率及患病率逐年升高，成為威脅人類健康的重大問題之一。糖尿病危害主要來自其并發(fā)癥，分為急性并發(fā)癥和慢性并發(fā)癥，其中慢性并發(fā)癥會(huì)引起神經(jīng)病變，臨床表現(xiàn)為四肢自發(fā)性疼痛、麻木感、感覺減退。味覺紊亂和味覺損傷是其慢性并發(fā)癥的表現(xiàn)之一，在口腔中表現(xiàn)為味覺感知能力的下降[1]。但糖尿病病人味覺感知能力改變的機(jī)制目前尚不清楚。味蕾是味覺感受的外周器官，所以作者通過STZ誘導(dǎo)建立糖尿病模型小鼠[2]；利用蘇木精-伊紅染色法及免疫組織化學(xué)方法分析糖尿病小鼠味蕾形態(tài)變化和味覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白表達(dá)變化，為糖尿病人味覺感知能力的改變機(jī)制提供味覺方面的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 8周大雄性ICR小鼠，購自浙江省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院，恒溫動(dòng)物房中飼養(yǎng)（溫度22±1℃，濕度 50%～60%），采用 12:12 h的白天/黑夜循環(huán)人工照明，自由進(jìn)食和飲水。

1.1.2 主要試劑 鏈脲佐菌素STZ:購自Sigma公司；檸檬酸，檸檬酸鈉，多聚甲醛:均購自上海生物工程有限公司；多克隆兔抗α-gustducin、PLCβ2及鼠抗SNAP25抗體:購自Santa Cruz公司；即用型SABC免疫組化試劑盒:購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型建立 8周大雄性ICR小鼠，動(dòng)物房適應(yīng)一周后（平均體重25 g），稱重分組[3-4]（實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組40只小鼠），禁食16～17 h，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射STZ溶液（0.1 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液中溶解，pH 4.4，滅菌，劑量180 mg/kg[5-6]）；對(duì)照組注射同等體積的檸檬酸鹽緩沖液。78 h后，使用One Touch Basic血糖儀（Lifescan，Milpitas，CA）測(cè)定小鼠血糖水平[7]，確定模型構(gòu)建成功率（血糖水平≥11.1 mmol/L為建模成功）。

1.2.2 舌組織取材及輪廓狀乳頭中味蕾形態(tài)分析小鼠CO2致死后，取舌，舌剪至輪廓狀乳頭邊緣處，4%的多聚甲醛中固定24～48 h。取1 cm×0.5 cm×0.5 cm含輪廓狀乳頭的舌組織進(jìn)行流水沖洗，常規(guī)石蠟包埋，10 μm連續(xù)冠狀切片，貼于蛋清包被的載玻片上，常規(guī)HE染色，實(shí)體顯微鏡記錄連續(xù)切片圖像，定量輪廓狀乳頭中味蕾數(shù)量；同一樣品連續(xù)數(shù)字圖像中隨機(jī)選取5張切片，每張切片隨機(jī)選取3～5個(gè)具有味孔味蕾,利用實(shí)體顯微鏡自帶軟件測(cè)量味蕾高度及寬度，通過以下公式計(jì)算味蕾橫截面積:

1.2.3 免疫組化和免疫熒光定量 α-gustducin、PLCβ2及SNAP25表達(dá) 小鼠CO2致死后取舌，4%的多聚甲醛中固定24～48 h后常規(guī)石蠟包埋，15 μm連續(xù)冠狀切片貼于蛋清包被的玻璃載玻片上，4℃短時(shí)間保存?zhèn)溆谩Ｇ衅撓灪髾幟仕猁}緩沖液中煮沸抗原修復(fù)，30%H2O2和甲醇 （1∶50） 溶液中30 min室溫孵育，PBS清洗后10%正常動(dòng)物血清及5%的牛血清白蛋白溶液封閉，室溫下孵育20 min，加入一抗，4 ℃孵育過夜（α-gustducin，1∶100；PLCβ2，1∶200；SNAP25，1∶200），PBS 清洗，PLCβ2 及 SNAP25操作按照博士德即用型SABC試劑盒說明書，DAB顯色緩沖甘油封片后后，Leica實(shí)體顯微鏡及CCD記錄結(jié)果；α-gustducin加入Cy3偶聯(lián)IgG，緩沖甘油封片后Leica SP2激光共聚焦顯微鏡下觀察記錄結(jié)果。省略一抗或用PBS代替作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。定量研究小鼠輪廓狀乳頭中味蕾中陽性反應(yīng)味蕾細(xì)胞數(shù)量，從小鼠舌面連續(xù)切片中隨機(jī)選取5張切片，每張切片選取3個(gè)最大橫截面積味蕾，10只小鼠共150個(gè)味蕾。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用Oringin 8.0對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05表示差異顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 輪廓狀乳頭中味蕾數(shù)量及形態(tài)變化

HE染色結(jié)果見圖1。對(duì)照組與糖尿病小鼠輪廓狀乳頭中味蕾總數(shù)及味蕾最大橫截面及之間無顯著差異，分別為 243.83±12.56 vs.231±7.78 （P=0.734 52）；1 621.79±232.78 vs.1 659±129.87 （P=0.899 45）。

圖1 輪廓狀乳頭中味蕾數(shù)量及形態(tài)Fig.1 Number and Morphology of circumvallate taste buds

2.2 α-gustducin、PLCβ2 及 SANP25 表達(dá)

α-gustducin、PLCβ2被認(rèn)為是味覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白（主要包括甜味、鮮味及苦味），而SNAP25是調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸小泡釋放神經(jīng)遞質(zhì)的重要蛋白[8]，與味覺信息傳遞息息相關(guān)，通過免疫組化技術(shù)分析了糖尿病小鼠與正常小鼠之間α-gustducin、PLCβ2及 SANP25表達(dá)差異。結(jié)果表明:α-gustducin、PLCβ2及SANP25在小鼠輪廓狀乳頭中味蕾中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，見圖2。而且糖尿病小鼠單個(gè)輪廓狀乳頭中味蕾中α-gustducin、PLCβ2免疫反應(yīng)性陽性味細(xì)胞數(shù)分別為6.95±0.37和10.24±0.48，顯著高于對(duì)照組小鼠單個(gè)味蕾中α-gustducin、PLCβ2免疫陽性細(xì)胞數(shù)（P=0.015 47＜0.05 和 P=0.000 43＜0.01），對(duì)照組小鼠單個(gè)味蕾中α-gustducin、PLCβ2免疫陽性細(xì)胞數(shù)均為4.38±0.23（圖3a和b）。與上述兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)相反，糖尿病小鼠單個(gè)輪廓狀乳頭中味蕾中SNAP-25免疫陽性細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組小鼠（P＜0.01），分別為 8.47±0.37 vs.11.57±0.53（圖 3c）。

圖2 α-gustducin、PLCβ2及SNAP-25輪廓狀乳頭中味蕾中表達(dá)Fig.2 α-gustducin，PLCβ2 and SNAP-25 immunoreactivity in circumvallate taste buds from diabetic mice

圖3 糖尿病小鼠及正常小鼠輪廓狀乳頭中味蕾中αgustducin、PLCβ2與 SNAP-25表達(dá)差異Fig.3 Quantitative comparision of taste cells displaying different immunoreactive to marker in diabetes and control mouse circumvallate taste buds

3 結(jié)語

味覺是呈味物質(zhì)溶解于口腔唾液后與味感覺受體作用，引起下游味覺信號(hào)傳導(dǎo)及釋放神經(jīng)遞質(zhì)，通過味覺傳入神經(jīng)將外周味覺信息傳遞到大腦，最終經(jīng)大腦分析后產(chǎn)生的感覺。味蕾（Taste bud，TB）是味覺感受的末端器官，主要分布于舌面上的各種味乳頭中（包括菌狀乳頭FF、葉狀乳頭FL和輪廓乳頭CV），一般由50～150個(gè)味覺細(xì)胞組成，而用于各種味覺感受的受體位于各種味細(xì)胞頂端的微絨毛上[9]。甜味、鮮味及苦味因?yàn)槠涫荏w均為GPCRs，具有相似的味覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特性及相似的下游味覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子包括G蛋白α亞基 （αgustducin）， 磷酸脂酶 Cβ2 （Phospho-lipase Cβ2，PLCβ2）， 瞬時(shí)受體離子通道 （Transient receptor potential iron channel，TRMP5）， 而這些蛋白質(zhì)的基因敲除小鼠的行為及神經(jīng)反應(yīng)結(jié)果，充分證明了其在三種味覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用[10-12]。所以糖尿病病人味覺感知能力的下降可能來自于味覺感受基礎(chǔ)的改變，包括味蕾解剖形態(tài)及味覺感受關(guān)鍵蛋白表達(dá)的變化。而本研究通過STZ誘導(dǎo)建立糖尿病模型小鼠，利用蘇木精-伊紅染色法及免疫組織化學(xué)方法分析糖尿病小鼠味蕾形態(tài)變化和味覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白表達(dá)變化結(jié)果表明，糖尿病小鼠與正常小鼠之間輪廓狀乳頭中味蕾數(shù)量及形態(tài)無顯著差異，表明味蕾解剖形態(tài)不是糖尿病小鼠味覺改變的主要原因。

α-gustducin、PLCβ2 及 SANP25 定量表達(dá)結(jié)果表明，與正常組小鼠相比，糖尿病小鼠輪廓狀乳頭中味蕾中上述味覺感受信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白顯著改變，用于味覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的α-gustducin及PLCβ2表達(dá)量顯著增加。 這一結(jié)果與 Pai（2008）[13]和 Zhou （2009）[14]等以大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的研究結(jié)果一致的，但似乎與糖尿病病人的味感知能力下降相悖，至于上述變化的產(chǎn)生尚無合理解釋。與代表味覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白α-gustducin及PLCβ2的結(jié)果相反，用于味覺信息傳遞控制神經(jīng)遞質(zhì)釋放的重要調(diào)節(jié)蛋白SNAP-25，同時(shí)也是味蕾信號(hào)傳遞前神經(jīng)突觸細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，在糖尿小鼠中表達(dá)顯著減少，而這種蛋白表達(dá)量降低可能導(dǎo)致外周味覺信息無法正常傳遞到味覺傳入神經(jīng)，進(jìn)而導(dǎo)致味覺感知能力下降及味覺損傷。而大量研究也表明糖尿病引起神經(jīng)系統(tǒng)退化和損傷[15]，這種作用在外周味覺感受上可能表現(xiàn)為味覺感受前神經(jīng)突觸神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的減少及與支配味覺細(xì)胞的味覺神經(jīng)退化，我們研究中SNAP-25免疫結(jié)果支持了上述觀點(diǎn)，同時(shí)Pai等[16]研究結(jié)果也證實(shí)了糖尿病大鼠支配味蕾的蕾內(nèi)神經(jīng)及蕾外神經(jīng)顯著退化。而這些神經(jīng)的退化可能是導(dǎo)致味蕾中不同類型細(xì)胞數(shù)量變化的重要原因[17]。而各種味蕾細(xì)胞的異常生長(zhǎng)致使正常味蕾內(nèi)部各種類型細(xì)胞比例結(jié)構(gòu)失調(diào)，從而最終導(dǎo)致味覺感知能力的下降。

綜上所述，利用STZ誘導(dǎo)構(gòu)建糖尿病小鼠模型及簡(jiǎn)單組織學(xué)免疫學(xué)方法，證明了糖尿病小鼠和正常小鼠之間輪廓狀乳頭中味蕾形態(tài)變化和味覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)變化異?？赡苁菍?dǎo)致糖尿小鼠味蕾異常的重要原因，主要表現(xiàn)在確定了味蕾解剖形態(tài)不是糖尿病小鼠味覺改變的主要原因；糖尿病小鼠α-gustducin、PLCβ2表達(dá)量增加，這似乎與味覺損傷相悖。而用于味覺信息傳遞控制神經(jīng)遞質(zhì)釋放的重要調(diào)節(jié)蛋白SNAP-25卻減少，SNAP-25減少表明用于味覺信號(hào)傳遞體系的破壞，主要是神經(jīng)信息的傳遞，從而導(dǎo)致味覺信號(hào)無法正常傳遞形成味覺異?；驌p傷?？傊?，本研究從一定程度上揭示了糖尿病引起味覺損傷的味覺方面基礎(chǔ)，這些可能為糖尿病病人食物設(shè)計(jì)提供一定理論依據(jù)。

[1]Claude Messier.Impact of impaired glucose tolerance and type 2 diabetes on cognitive aging[J].Neurobiology of Aging，2005，26:26-30.

[2]Koji Hayashi，Rhyoji Kojima，Mikio Ito.Strain differences in the diabetogenic activity of streptozotocin in mice[J].Biol Pharm Bull，2006，29（6）:1110-1119.

[3]劉建華，王勇，黃丹菲，等.泰和烏骨雞活性肽對(duì)小鼠骨髓有核細(xì)胞的增殖作用[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，30（2）:172-177.LIU Jian-hua，WANG Yong，HUANG Dan-fei，et al.Effect of taihe black-bone silky fowl （Gallus gallus domesticus Brisson）active peptides on proliferation of bone marrow nucleated cells from mice[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2011，30（2）:172-177.（in Chinese）

[4]蔣棟磊，孫秀蘭，張銀志，等.小鼠過敏模型在食品過敏原分析中的研究與應(yīng)用[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，31（5）:499-504.JIANG Dong-lei，SUN Xiu-lan，ZHANG Yin-zhi，et al.Construction and application of allergic models with ICR mice in vitro for analysis of food allergens[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2012，31（5）:499-504.（in Chinese）

[5]邵偉娟，陶凌云，趙茹茜，等.不同劑量STZ誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型及生殖能力的研究[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)科學(xué)版，2007，25（6）:541-546.SHAO Wei-juan，TAO Lin-yun，ZHAO Ru-qiang，et al.Mating ability of mouse diabetes mellitus models induced by diferent doses of streptozotocin[J].Journal of Shanghai Jiaotong University:Agriclutural Science，2007，25（6）:541-546.（in Chinese）

[6]李聰然，游雪甫，蔣建東.糖尿病動(dòng)物模型及研究進(jìn)展[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2005，15（1）:59-63.LI Cong-ran，YOU Xue-pu，JIANG Jian-dong.Advance in diabetes animal models[J].Chinese Journal of Comparative Medicine，2005，15（1）:59-63.（in Chinese）

[7]Takashi Okamoto，Naohide Kanemoto，Yutaka Ohbuchi，et al.Characterization of STZ-induced type 2 diabetes in zucker fatty rats[J].Exp Anim，2008，57（4）:335-45.

[8]Timothy A Gilbertson，Sami Damak，Robert F Margolskee.The molecular physiology of tastetransduction[J].Current Opinion in Neurobiology，2000，10（4）:519-527.

[9]Max M，Meyerhof W.Taste receptors[J].The Senses:A Comprehensive Reference，2008，4:197-217.

[10]Damark S，Rong M，Yasumatsu K，et al.Trpm5 null mice respond to bitter，sweet，and umami compounds[J].Chem Senses，2006，31:253-264.

[11]Zhang Y，Hoon MA，Chandrashekar J，et al.Coding of sweet，bitter，and umami tastes:different receptor cells sharing similar signaling pathways[J].Cell，2003，112:293-301.

[12]Dotson C D，Roper S D，Spector A C.PLCβ2-independent behavioral avoidance of prototypical bitter-tasting ligands[J].Chem Senses，2005，30:593-600.

[13]PAI Man-hui.Effects of streptozotocin-induced diabetes on taste buds in rat vallate papillae[J].Acta histochemica，2007，109:200-207.

[14]ZHOU Li-hong，LIU Xiao-min，F(xiàn)ENG Xiao-hong，et al.Expressionof α-gustducin in the circumvallate papillae of taste buds of diabetic rats[J].Acta histochemica，2008，111（2）:145-149.

[15]Ikuo Ohara，D Agr D M S，Ritsuko Tabuchi，et al.Effects ofmodified rice bran on serum lipids and taste preference in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Nutrition Research，2000，20（1）:59-68.

[16]Man-Hui Pai，Kuan-Hsun Huang，Ching-Hsiang Wu，et al.Effects of dietary arginine on inflammatory mediator and receptor of advanced glycation endproducts （RAGE）expression in rats with streptozotocin-induced type 2 diabetes[J].British Journal of Nutrition，2010，104（5）:686-692.

[17]Mistretta，C M.Aging effects on anatomy and neurophysiology of taste and smell[J].Gerodontol，1984，3:131-136.