許維娜 ， 王金晶 ， 陳 希 ， 李 崎 *

（1.江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

啤酒酵母是啤酒釀造的靈魂，活性高的強壯酵母在適當條件下能夠釀造出優(yōu)質(zhì)啤酒，酒體穩(wěn)定性好，無雜異味，爽口且貨架期長。如果使用衰老、活性低的酵母生產(chǎn)啤酒，酵母在發(fā)酵過程中容易自溶，并在自溶過程中釋放出對啤酒質(zhì)量有較大負面影響的物質(zhì)，產(chǎn)生酵母味，加重苦味、澀味，使酒體泡持性及穩(wěn)定性變差，嚴重影響啤酒質(zhì)量[1-2]。Babayan和Bezrukov將自溶定義為細胞死亡，胞內(nèi)生物聚合體在水解酶作用下形成低相對分子質(zhì)量產(chǎn)物的一種水解反應(yīng)，當細胞自身的胞內(nèi)酶開始起作用時，自溶就開始了[3]。在正常條件下，酵母中的蛋白酶不會跟細胞內(nèi)自身物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，不會發(fā)生細胞自溶；而當工藝條件和生存條件惡化時，酵母衰老受到各種物理化學作用的影響，蛋白酶開始降解胞內(nèi)自身物質(zhì)，導(dǎo)致酵母細胞壁破裂，酵母自溶隨之開始[4]。自溶液中含有從細胞中釋放出的多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、核苷酸、少量鹽類等物質(zhì)[5]。ASBC報道，在酵母自溶過程中，游離脂肪酸辛酸和癸酸的含量與其自溶有關(guān)，但測定方法比較復(fù)雜[6]；國外研究者通過實驗指出，可通過測定培養(yǎng)液中的腺苷酸激酶（AK）含量判定酵母的自溶，因為AK是一種胞內(nèi)酶，健康的細胞并不分泌或排泄該酶，但是該方法中所使用的儀器較難獲得[7]；Matteo Cavagna等人通過ATR-FTIR顯微技術(shù)和PCA技術(shù)的結(jié)合，能夠根據(jù)中紅外顯微紅外光譜觀察到起泡酒生產(chǎn)過程中酵母自溶的變化，但是該方法可操作性差[8]；王敏等人研究發(fā)現(xiàn)，酵母自溶過程中△非α-氨基氮/△α-氨基氮值在2.24～7.91之間，比值越小自溶程度越高，可以通過該比值判斷酵母自溶的程度[9]。作者綜合了酵母自溶過程中釋放的物質(zhì)種類及自溶液狀態(tài)變化情況，選取了α-氨基氮、甲醛氮、各種相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)、游離長鏈脂肪酸、酵母死亡率、以及溶液在260 nm與280 nm下分光光度值等指標對自溶液進行分析測定，探究操作性更強的酵母自溶評價方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

啤酒酵母青2（S.pastorianus）、啤酒酵母G-03（S.pastorianus）、啤酒酵母 C-03（S.pastorianus）、啤酒酵母 5-2（S.pastorianus）:均為工業(yè)菌株，由作者所在實驗室保藏；YEPD培養(yǎng)基:參照文獻[10]配制；酵母提取物和胰蛋白胨:購于英國OXOID公司；十七酸為進口色譜純標樣:購于美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

掃描電子顯微鏡QUANTA200F:美國FEI公司；紫外分光光度計UV-2000:美國Unico公司；凱式定氮儀Kjeltec 8200:瑞典Foss-Tecator公司；氣相色譜儀GC-2010:日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母樣品制備 參考王敏等[9]的方法培養(yǎng)和收集酵母，2 g酵母泥加到200 mL、pH 4.0的檸檬酸鹽緩沖液（模擬自溶液）中，于28℃放置，定時取樣測定。

1.2.2 酵母細胞掃描電鏡鏡檢 取自溶較快的菌株青2進行掃描電鏡鏡檢。分別取在YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h和在模擬自溶液中7 d的酵母，1 500 r/min離心10 min，收集菌體，進行掃描電鏡制樣、鏡檢。

1.2.3 酵母細胞死亡率的測定 定時對自溶液取樣，適當稀釋后與等量0.1%美藍染色液混勻，染色5 min后加到血球計數(shù)板上鏡檢，藍色為死細胞，無色為活細胞，記錄細胞總數(shù)和死細胞數(shù)。

酵母死亡率=死細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%

1.2.4 α-氨基氮的測定 參照文獻[11]進行，計算公式為:

游離 α-氨基氮（mg/L）=2×10×（A樣品/A甘氨酸）

1.2.5 甲醛氮的測定 參照文獻[11]進行，計算公式為:

其中，c為氫氧化鈉標準溶液質(zhì)量濃度，V為氫氧化鈉溶液用量（mL），14為每毫克當量氮的毫克數(shù)。

1.2.6 隆丁區(qū)分法測定蛋白質(zhì)含量 參照文獻[12]進行，各分子氮含量計算方法:

1.2.7 液液萃取—氣相色譜法測定游離長鏈脂肪酸含量 取75 mL濾液，加入十七酸標樣0.5 mL和氯化鈉10 g，用鹽酸調(diào)pH到3.5左右。加入20 mL 萃取劑（二氯甲烷∶甲醇=3∶1）充分振蕩萃取，分層后收集有機相，上層加入10 mL萃取劑再連續(xù)萃取兩次，合并后于5 000 r/min離心10 min，收集有機相于三角瓶中，加入無水硫酸鈉，封口膜封口，放入-18℃冷凍過夜。

將有機相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用萃取劑潤壁至3～5 mL左右，放入氨基小柱，用3 mL正己烷沖氨基小柱，然后用移液管向柱內(nèi)加萃取液，加樣量在3 mL左右，自然排干，用2 mL二氯甲烷∶異丙醇=1∶1混合溶液沖洗兩次，洗掉中性甘油酯，排干。移取2.5 mL 2%醋酸-甲基叔丁基醚，廢棄洗脫液。小柱下端接樣品瓶，再次加入2.5mL 2%醋酸-甲基叔丁基醚，收集洗脫液，充分混勻。濾液放于具塞比色管中。60℃水浴揮發(fā)至1 mL左右，冷卻，加入3 mL甲醇，3滴濃硫酸，混勻后60℃水浴中酯化30 min，冷卻后加入1 mL飽和氯化鈉和3 mL正己烷進行萃取，分層后取有機相于進樣瓶中進行氣相檢測[13-15]。

1.2.8 A260和A280的測定與比值計算 取一定量的緩沖液過濾，分別測濾液在260 nm和280 nm處的分光光度值，計算A260/A280比值。DNA純品的A260/A28為1.8，若比值高則說明含有RNA，比值低說明有殘余蛋白質(zhì)的存在[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母掃描電鏡結(jié)果

典型啤酒酵母青2在正常培養(yǎng)和自溶狀態(tài)下的掃描電鏡鏡檢結(jié)果分別見圖1和圖2。正常培養(yǎng)下的啤酒酵母呈橢圓球形，表面飽滿圓潤，有明顯的出芽現(xiàn)象和芽痕，而放置在模擬自溶液中經(jīng)過7 d之后的酵母細胞在8 000×的放大倍數(shù)下表面無明顯破損，但胞內(nèi)物質(zhì)流失嚴重，細胞干癟失形。這說明自溶過程中細胞壁的破壞是局部的、小規(guī)模的，而非大面積破裂。

圖1 青2在YEPD中培養(yǎng)20 h的掃描電鏡Fig.1 SEM of the strain QING 2 cultured in YEPD for 20 h

圖2 青2在模擬自溶液中7 d的掃描電鏡Fig.2 SEM of the strain QING 2 placed in citrate buffer for 7 d

2.2 酵母細胞死亡率的測定

酵母細胞在模擬自溶液中死亡率見表1。菌株5-2的死亡速率明顯比其他三株菌慢。

2.3 Δ非α-氨基氮/Δα-氨基氮與自溶時間的關(guān)系曲線的構(gòu)建

2.3.1 α-氨基氮的測定 對4株菌的模擬自溶液進行α-氨基氮的測定，結(jié)果見圖3。4株菌自溶液中的α-氨基氮質(zhì)量濃度在0～36 h內(nèi)增加緩慢，36 h之后增加速度明顯變快。其中菌株5-2的α-氨基氮質(zhì)量濃度明顯低于其他三株菌。

表1 不同酵母菌株在模擬自溶液中的死亡速度Table 1 Mortality rate of different strains in citrate buffer

圖3 不同菌株模擬自溶液中α-氨基氮質(zhì)量濃度變化Fig.3 Change of α-amino nitrogen of different strains in citrate buffer

2.3.2 甲醛氮的測定 對4株菌的模擬自溶液進行甲醛氮的測定，結(jié)果見圖4。0 h即剛放入時，模擬自溶液中的5-2、C-03和青2三株菌甲醛氮質(zhì)量濃度相差不大，而G-03的甲醛氮質(zhì)量濃度比其他三個菌株都高；四株菌甲醛氮質(zhì)量濃度均緩慢增加，其中以5-2增長速度最慢，總量最少。

圖4 不同菌株模擬自溶液中甲醛氮隨時間的變化Fig.4 Change of formaldehyde nitrogen of different strains in citrate buffer

2.3.3 酵母自溶過程中△非α-氨基氮/△α-氨基氮的變化規(guī)律 對測得的α-氨基氮、甲醛氮的含量進行分析處理，得到△非α-氨基氮/△α-氨基氮變化見圖5。結(jié)果表明，△非α-氨基氮/△α-氨基氮顯示出無規(guī)律變化的趨勢，無法獲得文獻[9]中所述的酵母自溶的判定指標，造成該結(jié)果的主要原因是:該實驗方法靈敏度較低，且步驟繁瑣，可重復(fù)性不強。

圖5 不同菌株模擬自溶液中Δ非α-氨基氮/Δα-氨基氮隨時間的變化Fig.5 Change of Δ non-α -amino nitrogen/Δα -amino nitrogen of different strains in citrate buffer

2.4 酵母自溶對不同相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的影響

用隆丁區(qū)分法對4株酵母菌株的模擬自溶液進行跟蹤測定，對模擬自溶液中大、中、小分子蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的變化以及各相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)在總蛋白中所占的比例進行了分析，結(jié)果見表2。其中菌株5-2的自溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度過低，無法用該法檢出。正常情況下，胞內(nèi)物質(zhì)進入外界環(huán)境需要經(jīng)過細胞膜和細胞壁的過濾（其中主要是細胞膜的作用），所以胞內(nèi)的大分子物質(zhì)無法釋放到胞外。從表2可以看出，隨著自溶時間的延長，3株菌株模擬自溶液中大、中、小分子蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度都在逐漸增多，且大、中分子蛋白質(zhì)在總蛋白質(zhì)的比例中呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，而小分子蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的比例則出現(xiàn)逐漸下降趨勢。如青2中高、中分子蛋白質(zhì)所占比例分別從2.81%、8.79%逐漸增加至7.22%、18.89%，而小分子蛋白質(zhì)從88.40%逐漸減少至73.89%?？梢?，在酵母細胞自溶過程中，隨著細胞膜與細胞壁上孔洞的增大，越來越多的大分子胞內(nèi)物質(zhì)釋放到環(huán)境中，使得外界環(huán)境中的大、中、小相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的比例發(fā)生改變。隆丁區(qū)分可以在一定程度上檢測酵母自溶過程中蛋白質(zhì)類物質(zhì)的變化，但操作繁瑣，檢測限高，不適用于判斷酵母的自溶情況。

表2 不同菌株模擬自溶液中各種蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度及比例變化Table 2 Change of content and proportion of proteins in citrate buffer

2.5 液液萃取-氣相色譜法測定游離長鏈脂肪酸質(zhì)量分數(shù)

啤酒中含量極低、極不穩(wěn)定的游離脂肪酸是影響啤酒風味重要因素之一。作者采用溶劑萃取和氣相色譜聯(lián)用技術(shù)對青2和C-03進行14個碳原子以上的長鏈游離脂肪酸質(zhì)量分數(shù)的檢測，檢測結(jié)果見表3。兩株酵母緩沖液中各游離脂肪酸以及所有游離脂肪酸的總和在0～5 d的時間內(nèi)變化均不明顯，且這些微小變化并不呈現(xiàn)確定的規(guī)律，可見，長鏈脂肪酸質(zhì)量分數(shù)無法作為判定酵母自溶的指標。

2.6 紫外吸收法測定核酸物質(zhì)的含量及純度

對模擬自溶液進行過濾之后測A260和A280的值，并計算其比值，結(jié)果見表4。A260/A280的比值與DNA純度有關(guān)，純DNA其比值為1.8，高于此值說明有RNA存在，低于此值有蛋白質(zhì)存在，該部分的計算結(jié)果均高于1.8，同時之前的實驗證明自溶液中蛋白質(zhì)的存在，因此說明了自溶液中RNA也存在。自溶開始時，酵母釋放出的蛋白類物質(zhì)比例較大，A260/A280的值較?。浑S著自溶程度的增大，自溶液中的核酸類物質(zhì)所占的比例越來越大，A260/A280的值逐漸增大，向2.0靠近。

酵母的自溶程度與酵母的死亡率有一定關(guān)系，但酵母死亡并不等同于自溶。該實驗中，對A260/A280與酵母死亡率進行擬合與分析，發(fā)現(xiàn)（A260/A280）/死亡率隨自溶程度的不同而呈現(xiàn)明顯且一致的變化趨勢，見圖 6。（A260/A280）/死亡率起始值較大（理論上 0 h時細胞死亡率為0，該值為+∞），之后逐漸減小，且酵母菌株自溶程度越高，該比值越小。當細胞死亡率趨近于 100%時，A260/A280逐漸趨近于 2.0，（A260/A280）/死亡率的值也趨近于2。雖然具體數(shù)據(jù)因菌種不同存在個體差異，但趨勢是完全相同的。該方法還可用于比較不同菌株的自溶性能，從結(jié)果可以看出，實驗所用4株菌自溶性能最好的是5-2，其次為C-03和G-03，青2最差，這與實際情況相符合。因此，該方法能夠較準確反映酵母自溶情況，因而能夠作為酵母自溶的判定指標。

圖6 不同菌株模擬自溶液中（A260/A280）/死亡率隨時間的變化Fig.6 Change of （A260/A280）/yeast mortality of different strains in citratce buffer

表3 青2、C-03模擬自溶液中游離脂肪酸隨時間的變化Table 3 Change of free long-chain fatty acid of QING 2 and C-03 in citrate buffer

表4 不同菌株模擬自溶液中A260/A260值隨時間的變化Table 4 Change of A260/A260of different strains in citrate buffer

3 結(jié)語

在啤酒釀造中，影響啤酒質(zhì)量的因素有很多，如:生產(chǎn)原料、水質(zhì)、啤酒酵母、酒花、環(huán)境溫度等，其中酵母菌種是影響啤酒質(zhì)量最主要的因素，如果有5%的酵母發(fā)生自溶，將對啤酒質(zhì)量造成難以挽回的影響[2，18]。為了提高啤酒質(zhì)量，國內(nèi)外學者對酵母自溶進行了諸多研究，國內(nèi)學者的研究多從實際生產(chǎn)出發(fā)，方法簡單快捷，但通常不是十分有效[5，19]；國外學者采用的方法因設(shè)備或技術(shù)限制，在國內(nèi)推廣的空間不大[6-8]。因此需要探索簡單、快捷、靈敏的方法用于檢測啤酒酵母的自溶情況。

作者選取了多個指標進行自溶評價的探索。因為酵母在發(fā)酵液中的自溶是一個緩慢而漫長的過程，并且發(fā)酵液中的很多物質(zhì)對測定結(jié)果有干擾[20]，所以本研究中的酵母自溶在人為創(chuàng)造的、營養(yǎng)匱乏的檸檬酸鹽緩沖液中進行。研究發(fā)現(xiàn)，隨著酵母自溶程度的增大，α-氨基氮、甲醛氮，溶液中大、中、小蛋白質(zhì)分子含量都有所增加，其中，大、中分子蛋白質(zhì)在總蛋白質(zhì)中的比例呈現(xiàn)逐漸增大趨勢，而小分子蛋白質(zhì)雖然含量增多，但所占比例呈現(xiàn)逐漸減小趨勢；而氣相色譜法測定游離脂肪酸的結(jié)果則表明，長鏈脂肪酸在酵母自溶過程中變化不明顯，且變化趨勢無規(guī)律可循。雖然上述部分實驗結(jié)果呈現(xiàn)一定的變化趨勢，但是個體差異明顯，且單一物質(zhì)的變化不適合用于判定酵母自溶情況，所以無法將這幾個因素直接作為判定酵母自溶情況的指標。A260/A280常用來反映核酸類物質(zhì)的純度，是一個綜合反映蛋白質(zhì)與核酸類物質(zhì)含量關(guān)系的物理量。而且酵母死亡率與自溶程度密切相關(guān)。本研究對A260/A280與酵母死亡率進行擬合，發(fā)現(xiàn)（A260/A280）/死亡率隨自溶程度的不同而呈現(xiàn)規(guī)律且一致的變化趨勢，即酵母菌株自溶程度越高，該比值越小。將實際自溶產(chǎn)物的 （A260/A280）/死亡率值與現(xiàn)有數(shù)據(jù)相比較，就可以得出酵母自溶的情況。該方法不僅可以用于判定同株酵母的自溶程度，還可用于比較不同菌株的自溶性能。因此，（A260/A280）/死亡率這一指標可用于選育自溶性能良好的啤酒酵母菌種用于工業(yè)生產(chǎn)，有助于預(yù)防酵母自溶給酒液帶來不良影響，并可以通過該標準對發(fā)酵后酵母泥中的酵母進行活性判定，以便于回收活性高的酵母用于下一批發(fā)酵。

[1]王敏，李崎，顧國賢.啤酒酵母自溶與細胞壁關(guān)系[J].生命的化學，2008，28（4）:504-506.WANG Min，LI Qi，GU Guo-xian.Relationship between autolysis of Saccharomyces cerevisiae and cell wall[J].Chemistry of Life，2008，28（4）:504-506.（in Chinese）

[2]高建民.淺析啤酒酵母自溶[J].啤酒科技，2009，2:56-57.GAO Jian-min.Analysis of yeast autolysis[J].Beer Science and Technology，2009，2:56-57.（in Chinese）

[3]Babayan，Bezrukov.Autolysis in yeast[J].Acta Biotechnol，1985，5:129-136.

[4]牛建興，王嘉林.啤酒酵母自溶的危害及其影響因素[J].釀酒科技，2011，12:73-75，78.NIU Jian-xin，WANG Jia-lin.The hazards and influencing factors of beer barm autolysis[J].Liquor-Making Science ＆Technology，2011，12:73-75，78.（in Chinese）

[5]華玉蒼，曲輝，張波，等.試論酵母自溶的判定指標[J].啤酒科技，2002，6:7-8.HUA Yu-cang，QU Hui，ZHANG Bo，et al.Discussion on the evaluation indexes of yeast autolysis[J].Beer Science and Technology，2002，6:7-8.（in Chinese）

[6]Ernest C H，Jamieson A M，Gheluwe G V.The release of fatty acids as a consequence of yeast autolysis[J].ASBC，1980，38（1）:13.

[7]劉素萍.通過測定胞外腺苷酸活性確定酵母自溶[J].啤酒科技，2003，11:53-55.LIU Su-ping.Determination of yeast autolysis through the determination of extracellular AK activity[J].Beer Science and Technology，2003，11:53-55.（in Chinese）

[8]Cavagna M，Dell'Anna R，Monti F，et al.Use of ATR-FTIR microspectroscopy to monitor autolysis of Saccharomyces cerevisiae cells in a base wine[J].J Agr Food Chem，2010，58:39-45.

[9]王敏，鄭飛云，劉春鳳，等.啤酒酵母自溶分析評價指標的研究[J].食品工業(yè)科技，2009，10:73-75，79.WANG Min，ZHENG Fei-yun，LIU Chun-feng，et al.Research on evaluation index of autolytic ability in brewing yeast[J].Science and Technology of Food Industry，2009，10:73-75，79.（in Chinese）

[10]Burke D，Dawson D，Stearns T.Methods in yeast genetics:A cold spring harbor laboratory course manual[M].New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，2000.

[11]管敦儀.啤酒工業(yè)手冊[M].北京:中國輕工業(yè)出版社，1982.

[12]范大雨.淺談蛋白質(zhì)隆丁區(qū)分[J].啤酒科技，2002，2:41-42.FAN Da-yu.Lundin fraction of proteins[J].Beer Science and Technology，2002，2:41-42.（in Chinese）

[13]劉春鳳，李崎，顧國賢，等.多級溶劑萃取-氣相色譜法測定啤酒中的游離脂肪酸[J].分析實驗室，2008，27（2）:26-29.LIU Chun-feng，LI Qi，GU Guo-xian，et al.Determination of free fatty acids in beer by multilevel solvent extraction-gas chromatography[J].Chinese Journal of Analysis Laboratory，2008，27（2）:26-29.（in Chinese）

[14]Urbanek A，Szadziewski R，Stepnowski P，et al.Composition and antimicrobial activity of fatty acids detected in the hygroscopic secretion collected from the secretory setae of larvae of the biting midge Forcipomyia nigra （Diptera:Ceratopogonidae）[J].J Insect Physiol，2012，58:1265-1276.

[15]劉景.啤酒風味老化機理及控制的研究[D].無錫:江南大學，2008.

[16]WU J N，Huu D，Manuel A C.Investigation of gaseous ozone as an anti-fungal fumigant for stored wheat[J].Chem Technol Biotechnol，2006，81:1288-1293.

[17]金麗琴.生物化學[M].杭州:浙江大學出版社，2007.

[18]孫付保，任洪艷，趙長新.離子對啤酒酵母代謝產(chǎn)酸的影響[J].食品與生物技術(shù)學報，2006，25（3）:63-66.SUN Fu-bao，REN Hong-yan，ZHAO Chang-xin.Ion influence on organic acid metabolized by beer yeast[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2006，25（3）:63-66.（in Chinese）

[19]王志堅.啤酒酵母自溶指標的判定[J].山東食品發(fā)酵，2011，4:27-29.WANG Zhi-jian.Determination of beer yeasts’ autolysis index[J].Shandong Food Fermentation，2011，4:27-29.（in Chinese）

[20]Martínez-Rodríguez A J，Polo M C，Carrascosa A V.Structural and ultrastructural changes in yeast cells during autolysis in a model wine system and in sparkling wines[J].Int J Food Micro，2001，71:45-51.