陶光燦， 李 勇， 崔廷婷， 王 嬌， 扶 勝

（北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206）

氨苯砜（dapsone，DDS）為砜類抑菌劑，對麻風(fēng)桿菌有較強的抑菌作用，大劑量使用時顯示殺菌作用[1]。由于其作用機制與磺胺類藥物相似，兩者具有協(xié)同增效作用，在動物和水產(chǎn)養(yǎng)殖中常作為磺胺增效劑使用[2]。然而氨苯砜毒性較大，可引起血液系統(tǒng)反應(yīng)，如高鐵血紅蛋白血癥和溶血性貧血，還可能出現(xiàn)肝腎功能損害和精神障礙[1，3]，因此我國農(nóng)業(yè)部235號公告明確規(guī)定禁止在所有食品動物中使用，且在動物性食品中不得檢出[4]；歐盟2377/90也明確規(guī)定氨苯砜為禁用藥物[2]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于食品中氨苯砜殘留檢測的報道較少，且多與磺胺類藥物同時檢測，方法主要為高效液相色譜法[5-6]和液質(zhì)聯(lián)用法[2，7-8]，儀器方法可以精確地進行定量分析，但設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、對樣品純度要求較高、檢測成本高、周期長，只能用于小批量樣本抽檢，無法滿足食品安全檢測中對大批量樣本現(xiàn)場快速篩查的需要[9]。而酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）具有特異性高、敏感性強、快速方便、不需要昂貴儀器設(shè)備、檢測成本低、適合于大批量樣品的檢測等優(yōu)點，已在農(nóng)獸藥殘留及微量毒素檢測中被廣泛應(yīng)用，但目前尚未見該技術(shù)在動物源性食品中氨苯砜殘留檢測中應(yīng)用的報道。因此，作者在利用合成的氨苯砜人工抗原，通過細胞融合技術(shù)制備出DDS單克隆抗體的基礎(chǔ)上，建立了動物源性食品中氨苯砜殘留的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法，為商品化試劑盒的研制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨苯砜（純度≥99%）、琥珀酸酐、吡啶、二甲基亞砜、碳化二亞胺、N，N-二甲基甲酰胺、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）:Sigma公司產(chǎn)品；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純:北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；復(fù)溶工作液:pH 7.6，含質(zhì)量分數(shù)8%～12%酪蛋白、0.1～0.3 mol/L的磷酸鹽緩沖液。

1.2 儀器與設(shè)備

8010S勻漿機:上海斯伯明儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；2000SBL電子天平:美國Setra公司產(chǎn)品；KS-Ⅱ振蕩器:上海躍進醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；QL-901漩渦混合器:海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；Anke TDL-40B低速離心機:上海安亭科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DSY-Ⅲ氮吹儀:北京金科精華苑科技有限公司產(chǎn)品；微量移液器（單道 20～200 μL、100～1 000 μL，多道 20～300 μL）:美國 Thermo 公司產(chǎn)品；DHP-600生化培養(yǎng)箱:天津市中環(huán)實驗電爐有限公司產(chǎn)品；MK3酶標儀:美國Thermo公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 氨苯砜半抗原的合成 0.50 g氨苯砜、0.40 g琥珀酸酐和2 mL吡啶在10 mL二甲基亞砜中混合，在60℃下攪拌反應(yīng)10 h，蒸除溶劑，柱層析后在乙醇-水體系中重結(jié)晶得到氨苯砜單琥珀酸酰胺，即為氨苯砜半抗原。

1.3.2 氨苯砜人工抗原的制備及鑒定

1）氨苯砜免疫原的制備 取氨苯砜半抗原12 mg用1.5 mL N，N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液Ⅰ；取質(zhì)量分數(shù)50%的戊二醛10 μL加入溶液Ⅰ中，室溫下攪拌反應(yīng)18 h，得到溶液Ⅱ；取牛血清白蛋白60 mg用4.5 mL水稀釋后加入溶液Ⅱ中，反應(yīng)過夜后加入24 mg NaBH4反應(yīng)3 h，用三蒸水透析48 h，即得氨苯砜免疫原。

2）氨苯砜包被原的制備 取碳化二亞胺50 mg用2 mL水使之充分溶解，得到溶液A；取氨苯砜半抗原13 mg用1 mL N，N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液B；取卵清蛋白30 mg溶于2 mL 0.01 mol/L PBS（pH=8.0）溶液中，得到溶液C；將B液與C液混合，在磁力攪拌下逐滴加入A液中，室溫下攪拌反應(yīng)24 h，用三蒸水透析48 h，即得氨苯砜包被原。

3）人工抗原的鑒定及偶聯(lián)比測定 采用TNBS方法[10]初步鑒定了人工抗原的合成情況，并測定了氨苯砜半抗原與牛血清白蛋白和卵清蛋白的偶聯(lián)比。

1.3.3 單克隆抗體的制備 用150 μg的氨苯砜免疫原與等量弗氏完全佐劑（FCA）混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射。二免和三免時，將FCA換成弗氏不完全佐劑（FIA），劑量和方法同上，每次免疫間隔時間為2周，三免后第7 d，小鼠尾部靜脈采血，室溫靜置1 h，4℃過夜，12 000 r/min離心10 min，收集血清，4℃保存，用間接ELISA法測定血清效價，待效價較高時，按照150 μg/只的劑量腹腔注射加強免疫。3 d后取小鼠脾臟進行細胞融合，以有限稀釋法篩選陽性克隆，并按照常規(guī)方法制備腹水抗體[11]，用飽和硫酸銨法純化后備用。

1.3.4 酶聯(lián)免疫方法的建立

1）抗原抗體最佳工作濃度的確定 采用方陣滴定法確定包被抗原 （氨苯砜半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物）與單克隆抗體的最佳工作濃度。每孔加入100 μL最佳工作濃度的包被原包被酶標板，37℃溫育2 h；傾去包被液，經(jīng)PBST洗滌液洗滌3次，用封閉液37℃條件下封閉2 h，洗滌3次，干燥備用。向包被有包被原的酶標板微孔中加入氨苯砜標準品溶液50 μL，隨機加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體溶液50 μL，再加入最佳工作濃度的單克隆抗體溶液 50 μL，用蓋板膜封板，25℃反應(yīng) 30 min，用洗滌液洗滌4～5次。每孔再加入底物液A液（過氧化脲）和 B 液（四甲基聯(lián)苯胺）各 50 μL/孔，25 ℃顯色 15 min后每孔加入 50 μL 2 mol/L H2SO4終止液，設(shè)定酶標儀于450 nm處測定每孔吸光度值。

2）標準曲線的制作 采用間接競爭ELISA方法建立標準曲線，分別選擇標準品質(zhì)量濃度0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μg/L，以質(zhì)量濃度為 0 μg/L 時的OD值為B0值，其它濃度氨苯砜標準品的OD值為B值，以百分吸光度值（B/B0）為縱坐標，標準品濃度的對數(shù)值為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.5 樣本前處理方法的建立

1）雞肉、豬肉前處理方法 稱?。?.0±0.05）g樣本至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入7.5 mL乙腈和 0.5 mL 水，振蕩 2 min，4 000 r/min 室溫（20～25℃）離心5 min；取出2 mL上層有機相至10 mL干凈的玻璃試管中，50℃下氮氣吹干或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干；加入1 mL正己烷，渦動30 s，再加入1 mL復(fù)溶工作液，渦動 30 s；室溫（20～25 ℃）4 000 r/min 離心5 min；除去上層有機相，取下層50 μL用于分析。

2）雞蛋、蜂蜜前處理方法 稱?。?.0±0.05）g樣本至10 mL離心管中；加入4 mL去離子水，振蕩30 s，取上層清液200 μL加入600 μL復(fù)溶工作液混勻；取50 μL用于分析。

3）牛奶前處理方法 取100 μL樣本至2 mL離心管，加入 500 μL 復(fù)溶工作液，混勻；取 50 μL用于分析。

1.3.6 酶聯(lián)免疫方法技術(shù)參數(shù)的確定

1）樣本檢測限試驗 取空白樣本20份，按1.3.4所述方法前處理后進行ELISA檢測，從標準曲線上查出對應(yīng)于各百分吸光度值的氨苯砜濃度，以20份樣本的質(zhì)量分數(shù)平均值（）和標準差（S）表示檢測限（MDL），即 MDL=+3S。

2）準確度和精密度試驗 以3個不同質(zhì)量分數(shù)的氨苯砜標準品分別對空白雞肉、豬肉、雞蛋、蜂蜜、牛奶樣本進行添加回收試驗，計算回收率和變異系數(shù)。

式中:CX為添加了一定氨苯砜的樣本經(jīng)過標準曲線分析得到的實際質(zhì)量分數(shù)，μg/kg；C0為空白樣本經(jīng)過標準曲線分析得到的實際質(zhì)量分數(shù)，μg/kg；C為實際添加的氨苯砜質(zhì)量分數(shù)，μg/kg。

3）穩(wěn)定性試驗 將酶聯(lián)免疫方法相關(guān)的試劑組裝成試劑盒后，取足量保存于37℃環(huán)境中，每隔1 d取出適量，分別測定零標準品的OD值、半數(shù)抑制濃度（IC50），及按2）所述方法進行添加回收試驗所測得的回收率，直到試劑盒的靈敏度和回收率開始下降為止，根據(jù)試驗結(jié)果判斷試劑盒的穩(wěn)定性。

4）可靠性試驗 隨機抽取雞肉、豬肉、雞蛋、蜂蜜、牛奶樣本各20份，用本方法與標準方法《SN/T 2219—2008進出口動物源性食品中氨苯砜及其代謝產(chǎn)物殘留量檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（對雞肉、豬肉、雞蛋和牛奶中氨苯砜的測定低限為0.5 μg/kg）[12]和《GB/T 22940—2008 蜂蜜中氨苯砜殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（方法檢出限為2.0 μg/kg）[13]分別對其進行檢測，根據(jù)試驗結(jié)果驗證ELISA方法檢測實際樣本的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨苯砜半抗原與載體蛋白偶聯(lián)比的測定

通過TNBS法證明偶聯(lián)反應(yīng)是成功的，并測得半抗原與BSA的偶聯(lián)結(jié)合比為10.45∶1，與OVA的偶聯(lián)結(jié)合比為7.28∶1。TNBS能特異性地與蛋白質(zhì)分子上的自由氨基結(jié)合，專一性比較強，對儀器要求更低，操作也較簡單。

2.2 最佳工作質(zhì)量濃度的選擇

方陣法測定不同包被原和單克隆抗體的間接競爭抑制ELISA測定結(jié)果 （A450nm值）見表1。在ELISA包被過程中，包被效果與濃度呈正相關(guān)，但濃度過高，不僅浪費試劑，而且會降低待測物的競爭能力，從而影響曲線靈敏度[14]?？紤]到酶標儀測定OD450nm值的敏感范圍在1.00左右，為了既保證測定結(jié)果的靈敏可靠，又減少抗原的用量，試驗應(yīng)選擇的最適包被原稀釋倍數(shù)為1∶40 000，最佳抗體稀釋倍數(shù)為 1∶100 000。

2.3 標準曲線的建立

根據(jù)建議的間接競爭ELISA方法，選擇氨苯砜標準品質(zhì)量濃度 0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μg/L， 以百分吸光度值（B/B0）為縱坐標（Y），標準品質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標（X）繪制標準曲線如圖1。以lg（B/B0）為縱坐標，標準品濃度的對數(shù)值為橫坐標，將圖1轉(zhuǎn)換后可知，在0.1～8.1 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，lg（B/B0）與氨苯砜濃度對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖 2）， 得回歸方程 Y=-2.492 6X-0.982 4，R2=0.995 6，IC50為 0.369 μg/L。

圖1 氨苯砜的標準曲線Fig.1 Calibration curve of dapsone by ELISA

圖2 氨苯砜的檢測標準曲線Fig.2 Calibration curve for detection of dapsone by ELISA

2.4 樣本檢測限

一定條件下，ELISA方法檢測限（MDL）符合正態(tài)分布的規(guī)律[15]，因此用20個空白樣本通過ELISA測定的光密度在標準曲線上對應(yīng)的氨苯砜濃度的平均值（）和標準差（S）來表示，即 MDL=+3S，結(jié)果見表2。綜合考慮幾種樣本的檢測限數(shù)據(jù)，得本方法對雞肉、豬肉樣本的檢測限為0.2 μg/kg，對雞蛋、蜂蜜樣本的檢測限為2 μg/kg，對牛奶樣本的檢測限為 0.6 μg/L。

表2 酶聯(lián)免疫方法對不同樣本的檢測限Table 2 Detection limit for different samples of ELISA

2.5 準確度和精密度

ELISA測定的準確度以回收率表示，精密度以變異系數(shù)表示。取空白雞肉、豬肉、雞蛋、蜂蜜、牛奶樣本，按表3所述的氨苯砜添加質(zhì)量分數(shù)對其進行添加回收試驗，每個質(zhì)量分數(shù)做5個平行，用3個批次的產(chǎn)品測定，分別計算回收率和批內(nèi)、批間變異系數(shù)，結(jié)果見表3。

表3 酶聯(lián)免疫方法的準確度和精密度Table 3 Accuracy and precision of ELISA

由表3可知，以3個不同質(zhì)量分數(shù)的氨苯砜標準品對空白雞肉、豬肉、雞蛋、蜂蜜、牛奶樣本進行添加，其加標回收率范圍為78.2%～104.0%，說明方法準確度較好；批內(nèi)變異系數(shù)范圍為5.2%～11.4%，批間變異系數(shù)范圍為7.4%～13.5%，均小于15%，說明方法精密度（重復(fù)性）較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

將ELISA方法涉及到的各種試劑組裝成試劑盒后在37℃條件下存放，每隔1 d取出，測定靈敏度和回收率等參數(shù)，結(jié)果見表4。經(jīng)測定，該試劑盒能在37℃條件下穩(wěn)定保存9 d，第10 d開始各項參數(shù)下降。根據(jù)生化試劑在37℃每穩(wěn)定1 d，相當于4～10℃保存一個半月[16]，可知，試劑盒可在4℃下至少穩(wěn)定保存12個月。

表4 酶聯(lián)免疫試劑盒穩(wěn)定性測定Table 4 Stability of the ELISA kit

2.7 可靠性驗證

通過ELISA方法和儀器方法對隨機抽取的雞肉、豬肉、雞蛋、蜂蜜、牛奶樣本進行測定，雞肉、豬肉樣本的陽性判定線為0.5 μg/kg，雞蛋、蜂蜜樣本的陽性判定線為2 μg/kg，牛奶樣本的陽性判定線為0.6 μg/L，結(jié)果篩選出7份陽性樣本，比較結(jié)果見表5。

表5 ELISA法和LC-MS/MS法檢測結(jié)果比較Table 5 Comparison determination results of ELISA with LC-MS/MS

由表5可知，用ELISA法和LC-MS/MS法的測定結(jié)果基本一致，符合度達到100%，適用于動物源性食品中氨苯砜殘留的篩選。

3 結(jié)語

氨苯砜（DDS）為小分子物質(zhì)，不具備免疫原性，只有反應(yīng)原性，因此需要與一大分子物質(zhì)共價結(jié)合后才能使動物免疫系統(tǒng)識別，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。合成免疫抗原通常采用小分子物質(zhì)與載體蛋白直接偶聯(lián)的方法，但是由于DDS相對分子質(zhì)量較小，含有的可反應(yīng)基團較少，使與載體蛋白偶聯(lián)上的可能性大大降低；同時其結(jié)構(gòu)簡單，與載體蛋白偶聯(lián)后由于缺少間接臂，可能影響DDS與抗體的特異性識別。因此，本研究先對DDS小分子物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)改造，在保留其基本結(jié)構(gòu)特征的基礎(chǔ)上引入一定長度的間接臂，然后再與蛋白偶聯(lián)，可以制備得到較高偶聯(lián)比的人工抗原，在免疫時更易誘發(fā)產(chǎn)生特異性抗體。

目前，用高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測食品中氨苯砜的定量下限多在0.12～5 μg/kg。作者建立的檢測方法的半數(shù)抑制濃度 （IC50）為0.369 μg/L，對雞肉、豬肉樣本的檢測限為0.2 μg/kg，對雞蛋、蜂蜜樣本的檢測限為2 μg/kg，對牛奶樣本的檢測限為0.6 μg/L，與儀器方法相比，靈敏度較低。但由于ELISA方法對儀器、樣品純度和技術(shù)人員的要求不高，操作簡便，檢測時間短（45 min）、成本低，適合于大量樣本中氨苯砜殘留檢測的快速篩選，能夠更好地滿足我國基層檢測單位、政府職能監(jiān)管部門等開展檢測工作，具有較好的應(yīng)用前景。

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