陳忠法， 唐存多， 汪俊卿， 吳 靜， 鄔敏辰*

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫 214122）

木聚糖是植物細胞壁的主要結(jié)構(gòu)多糖物質(zhì)之一，在自然界中含量極為豐富。木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一類酶的總稱，能從木聚糖分子主鏈的內(nèi)部水解β-1，4糖苷鍵，產(chǎn)物為不同長度的木寡糖和少量木糖，為木聚糖降解酶系中最關(guān)鍵的酶[1]。通過酶分子一級結(jié)構(gòu)的序列比對和疏水簇分析，大多數(shù)木聚糖酶屬于糖苷水解酶10和11家族[2]。木聚糖酶在造紙、食品、能源、飼料以及環(huán)境等領(lǐng)域里都有著重要的應用價值，但由于一些工藝過程如食品、飼料制粒加工等需要較高工作溫度[1]，而天然酶往往難以滿足其生產(chǎn)要求，因此，如何提高木聚糖酶的熱穩(wěn)定性已成為廣泛關(guān)注的焦點。

影響木聚糖酶熱穩(wěn)定性的因素很多，主要有疏水作用、氫鍵、離子鍵、二硫鍵、包裝效應、螺旋結(jié)構(gòu)等多種因素[3]。目前對于11家族木聚糖酶熱穩(wěn)定性提高的報道有很多是關(guān)于酶的N端的改造，例如，Duman等對一種11家族木聚糖酶的N端進行了7個定點突變，突變酶比野生酶的Tm值提高了約25℃[4]；Xiong等在一種里氏木霉木聚糖酶的N端和中部β折疊處引入二硫鍵，突變酶DB1比野生酶在65℃時的半衰期提高約112倍[5]；高樹娟等把一種超耐熱木聚糖酶N端前42個氨基酸替代了一種米曲霉木聚糖酶前37個氨基酸，突變酶比野生酶在70℃時的半衰期提高約197倍[6]。

作者已克隆和表達了一個來自Aspergillus oryzae的11家族常溫木聚糖酶基因Aoxyn11A，該酶在常溫條件下酶活性比較高，但溫度大于50℃時熱穩(wěn)定性差[7]，存在應用上的不足。通過同源建模和分子動力學模擬分析評估的基礎(chǔ)上，采用定點突變技術(shù)，期望獲得一株表達高熱穩(wěn)定性木聚糖酶的工程菌。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

含有原始基因的重組質(zhì)粒pUCm-TAoXyn11A，pPIC9KM-Aoxyn11A由作者所在實驗室構(gòu)建和保存；Escherichia coli DH5α、Pichia pastoris GS115和表達質(zhì)粒pPIC9KM由作者所在實驗室保藏；pUCm-T質(zhì)粒:購自上海 Sangon公司；LB、YPD、MD、BMGY和 BMMY培養(yǎng)基參見 Multi-Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen 公司）操作手冊。

1.2 主要試劑

rTaq酶、T4 DNA連接酶、各種限制性內(nèi)切酶、250 bp DNA Ladder Marker和低相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker:購于大連TaKaRa公司；Tryptone、Yeast Extract、YNB、G418 和 EZ-10 Spin Column Plasmid Mini-Preps Kit:購自上海Sangon公司；標準木糖、櫸木木聚糖、樺木木聚糖和考馬斯亮藍R-250:Sigma公司產(chǎn)品；其它試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.3 野生型酶AoXyn11A和超耐熱木聚糖酶EvXyn11TS序列的對比

超耐熱酶EvXyn11TS是屬于木聚糖酶11家族中熱穩(wěn)定性最高的酶之一[4]。作者所在實驗室登錄NCBI將其進行密碼子優(yōu)化，選擇Pichia pastoris GS115偏愛型的密碼子，然后人工合成了這段序列（Syxyn11，GenBank accession No.JX459567）， 該優(yōu)化基因在Pichia pastoris GS115中表達，測其最適溫度在反應時間為15 min時為85℃，其最高酶活達到17.74 U/mL；在80℃保溫60 min后，保留未熱處理原酶85.9%的活性，進一步證實了該酶有很高的熱穩(wěn)定性[8]。本研究擬采用DNAMAN程序?qū)δ揪厶敲窤oXyn11A（GenBank accession No.JQ326257）和超耐熱酶EvXyn11TS進行N端氨基酸序列同源比對，希望找出與酶分子熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸殘基。

1.4 計算機同源建模和分子動力學模擬

在Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫中進行同源搜索，尋找到3個與AoXyn11A一級結(jié)構(gòu)同源性較高的、分別來源于繩狀青霉菌Penicillium funiculosum（1TE1）、E.coli （2VUL） 和紅褐 肉座菌 Hypocrea jecorina（1ENX）的11家族木聚糖酶晶體結(jié)構(gòu)，作為同源建模的模板。同源建模在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)服務(wù)器（http:/swissmodel.expasy.org/） 和 程 序 MODELLER 9.9（http://salilab.org/modeller/）上完成[9]。

分子動力學（MD）模擬使用GROMACS 4.0軟件，采用GROMOS96力場，該力場中蛋白的立場參數(shù)數(shù)據(jù)均給予實驗值擬合模擬溫度為500 K，溶劑采用TIP3P水模型。對于每個模擬體系，均在溶質(zhì)外圍加上1.5 nm的水分子層。MD模擬之前，對體系分別進行了兩次能量優(yōu)化，首先約束溶質(zhì)，用最陡下降法優(yōu)化800步，再用共軛梯度法優(yōu)化1 200步。然后去約束后再進行800步最陡下降法優(yōu)化，1200步共軛梯度法優(yōu)化。MD模擬分為兩步:首先進行20 ps的約束溶質(zhì)分子的MD模擬，此時溫度從0 K逐步升高到500 K；接著進行500 ps的無約束恒溫MD模擬，最后分別得到野生型酶和突變酶的均方根偏差（RMSD）值。

1.5 定點突變引入N端二硫鍵

1.5.1 引物的突變 根據(jù)木聚糖酶基因Aoxyn11A和目的突變位點設(shè)計引物（表1）。

表1 引入二硫鍵的引物Table 1 Oligonucleotide primers for the introduction of a disulfide bridge

1.5.2 定點突變程序 （1）大引物PCR程序按照相關(guān)文獻[10]的步驟操作。（2）兩步PCR程序，第一步PCR:質(zhì)粒pUCm-T-AoXyn11A為PCR模板，用引物Xyn11-F和Xyn11-Rm進行擴增，擴增條件:94℃預變性 5 min；94℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，產(chǎn)物為含突變位點的N端前108個堿基。第二步PCR:取以上PCR產(chǎn)物，以割膠回收物為N端大引物，Xyn11-R為C端引物進行擴增。擴增條件:94℃預變性5 min；94 ℃變性 30 s，45 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s；72℃延伸10 min?；厥漳康幕?，連接到pUCm-T載體上，獲得重組質(zhì)粒pUCm-T-Aoxyn11AM，對其進行測序驗證。

1.6 突變酶基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建

pPIC9K載體在畢赤酵母表達時，許多情況下Stel13切割Glu-Ala重復片段效率不高，Glu-Ala重復序列就留在了表達目的蛋白的N端，作者采用pPIC9KM（專利號 201110410391.0）載體，在其 N 端引入Kex2裂解位點，以保證表達目的蛋白具有天然N端[11]。將質(zhì)粒pUCm-T-AoXyn11A用XhoⅠ和NotⅠ進行雙酶切，回收目的片段，與經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒pPIC9KM連接，轉(zhuǎn)化Escherichia coli DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)通用引物PCR驗證后，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pPIC9KM-Aoxyn11A。

1.7 野生型酶和突變酶基因在Pichia pastoris中的表達

將質(zhì)粒pPIC9KM-Aoxyn11A和pPIC9KMAoxyn11AM用SacⅠ線性化后，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母，挑取陽性轉(zhuǎn)化子。電轉(zhuǎn)化及篩選方法參見Invitrogen公司的操作手冊。重組酵母的培養(yǎng)、誘導表達和檢測的具體方法見文獻。

1.8 木聚糖酶的活性測定

采用改進的DNS法測定木聚糖酶活性。2.4 mL質(zhì)量分數(shù)0.5%櫸木木聚糖溶液 （pH 5.5）加入0.1 mL適當稀釋的酶液，50℃下反應10 min后，加入2.5 mL DNS試劑，沸水中顯色7 min，定容后測定A540nm。在上述反應條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量定義為一個酶活性單位 （U）。

1.9 酶學性質(zhì)分析

1.9.1 酶的最適反應溫度和熱穩(wěn)定性 取適當稀釋酶液于40～75℃水浴條件下進行酶解反應，每隔5℃測定酶活性，以最高者為100%，作溫度-相對酶活性曲線；將酶液于不同溫度下保溫30 min后，按常規(guī)方法測定殘余酶活性，以未保溫處理酶液的活性定義為100%，作溫度-相對酶活性曲線。反應所用的緩沖液為0.1 mol/L檸檬酸-磷酸緩沖液（pH 5.5）。

1.9.2 酶的最適pH和pH穩(wěn)定性 取適當稀釋酶液，溫度為最適反應溫度，在pH 3.0～8.5的條件下進行酶解反應，每隔0.5個pH單位測定酶活性，以最高者為100%，作pH-相對酶活性曲線；將酶在不同的pH值條件下于40℃保溫1 h，再分別測定殘留酶活性，以最高者為100%，作pH-相對酶活性曲線。反應所用的緩沖液為:0.1 mol/L檸檬酸-磷酸緩沖液（pH 3.5～8.0）和 0.05 mol/L 甘氨酸-氫氧化納緩沖液（pH 8.5）。

1.9.3 酶動力學參數(shù)的測定 底物為不同濃度的樺木木聚糖溶液 （0.1 mol/L檸檬酸-磷酸緩沖液配置，pH 5.5），在酶的最適溫度下測定其活性，按Lineweaver-Burk法作圖，求出酶的Km和Vmax值。

2 結(jié)果與分析

2.1 米曲霉木聚糖酶和超耐熱酶氨基酸序列的比對

圖1序列比對顯示它們的N端氨基酸殘基序列相似性為43.5%，EvXyn11TS含有二硫鍵和糖基化位點（見圖1），而后面的氨基酸殘基序列的相似性在70%以上。作者擬以AoXyn11A為母本，在對應于EvXyn11TS的位置上對這兩個基因進行同源建模和分子動力學模擬分析

圖2顯示突變酶AoXyn11AM和野生型酶AoXyn11A相比較，其N端增加一個二硫鍵 （C5和C32，藍色標識），但是它的三維結(jié)構(gòu)和活性中心并沒有受到影響。

圖1 AoXyn11A和EvXyn11TS的N端同源序列比對Fig.1 N-terminal amino acid homology alignment of AoXyn11A with EvXyn11TS

圖2 通過同源建模預測的AoXyn11A和AoXyn11AM分子結(jié)構(gòu)Fig.2 Predicted molecular structures of AoXyn11A and AoXyn11AMby homology modeling

分子動力學模擬顯示（圖3），隨著模擬高溫時間的延長，突變酶的RMSD值在各個時間點都低于野生型酶，預示著突變酶在模擬高溫環(huán)境中變形小于野生型酶，具有更好的熱穩(wěn)定性。

2.2 原基因的定點突變

以原基因為模板、N端引物Xyn11-F、C端引物Xyn11-Rm經(jīng)大引物PCR法擴增獲得含有突變位點（Cys5-Cys32）的片段，該片段和理論長度（120 bp，圖4a）相符。以該片段為N端引物，C端引物為Xyn11-R進行PCR，獲得目的片段Aoxyn11AM與理論長度（602 bp，圖4b）相符。把目的片段克隆進pUCm-T載體，挑選陽性克隆子經(jīng)測序驗證，證明重組質(zhì)粒pUCm-T-Aoxyn11AM含有目的基因。

圖3 AoXyn11A和AoXyn11AM的RMSDFig.3 RMSD values of AoXyn11A and AoXyn11AM

圖4 定點突變過程Fig.4 Process of site-directed mutagenesises

2.3 重組表達質(zhì)粒pPIC9KM-Aoxyn11AM的構(gòu)建

按照1.6的方法構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，經(jīng)通用引物PCR擴增，目的條帶與理論長度 （1 076 bp，圖4c）相符，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pPIC9KMAoxyn11AM。

2.4 野生型酶和突變酶基因在Pichia pastoris中的表達

野生型酶和突變酶的理論相對分子質(zhì)量分別為20 700和21 200，與圖5顯示的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大致相符，表明野生型酶和突變酶基因在畢赤酵母中得到了精確的表達。

圖5 AoXyn11A和AoXyn11AM在畢赤酵母中表達后的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of AoXyn11A and AoXyn11AM expressed in Pichia pastoris GS115

2.5 重組木聚糖酶酶學性質(zhì)

2.5.1 最適反應溫度與熱穩(wěn)定性 在1.9描述的方法和條件下，反應時間為10 min時，圖6顯示野生型酶的最適反應溫度為55℃，此時該酶的最大酶活性為333 U/mL；突變酶的最適反應溫度為60℃，此時該酶的最大酶活性為250 U/mL。隨著溫度升高，高溫使酶蛋白逐漸變性而失活，引起酶反應速率下降，在55～75℃這一區(qū)間，由于N端引入了二硫鍵，其形成對構(gòu)象起穩(wěn)定作用，使突變酶表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，其變性慢于野生型酶，因而表現(xiàn)出相對較高的相對酶活性，這一結(jié)果和分子模擬比對是一致的。

把這兩種酶置于不同的溫度中保溫30 min后，由圖7顯示，隨著溫度的升高，突變酶的相對酶活性一直高于野生型酶，表明該二硫鍵使突變酶具有更好的熱穩(wěn)定性。

圖6 溫度對AoXyn11A和AoXyn11AM活性的影響Fig.6 Effectsoftemperatureson theactivitiesof AoXyn11 and AoXyn11AM

圖7 溫度對AoXyn11A和AoXyn11AM熱穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of temperatures on the thermostability of AoXyn11A and AoXyn11AM

2.5.2 酶的最適pH與pH穩(wěn)定性 圖8顯示這兩種酶的最適pH集中在pH 5～6之間，pH穩(wěn)定性測試結(jié)果也大致相同，說明突變酶的酸堿耐受性變化不大。

圖8 pH對AoXyn11A和AoXyn11AM活性的影響Fig.8 Effects of pH on the activities of AoXyn11A and AoXyn11AM

2.5.3 酶的比酶活和Km在1.9的方法和條件下，測得野生型酶的比酶活為3 490 U/mg，Km為7.67 mg/mL；突變酶的比酶活為2480 U/mg，Km為2.75 mg/mL。對這一現(xiàn)象的推測是由于突變酶引入了二硫鍵而具有較好的穩(wěn)定性，在適量的底物濃度時，和底物結(jié)合更加緊密和快速，表現(xiàn)出低的Km值；當?shù)孜餄舛瘸^一定量時，野生型酶由于整體柔性較好，能夠隨著底物量的增多而舒展結(jié)構(gòu)，結(jié)合更多的底物并參加反應，表現(xiàn)出高的Vmax。

3 結(jié)語

自然界酶的種類雖然比較多，但是全球飛速發(fā)展的經(jīng)濟對生物催化提出各不相同的要求。分析某個催化過程，利用基因工程手段對酶進行定點突變，從而改變酶的特定的酶學性質(zhì)，使目的催化過程以最經(jīng)濟、最環(huán)保的方式完成，這對于我國加快經(jīng)濟結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)型，搶占技術(shù)至高點具有重要意義。通過目的酶和耐熱酶的序列比對能夠有效的確定具有“熱穩(wěn)定效應”的氨基酸殘基和相關(guān)的模式結(jié)構(gòu)，提示了生物大分子對溫度的進化適應，但是通常情況下只有一小部分的氨基酸的突變能夠提高熱穩(wěn)定性，絕大部分的突變僅僅是“基因漂移”的結(jié)果。依靠計算機輔助設(shè)計，如同源建模、分子模擬等方法可以使我們更有效的預測出與酶熱穩(wěn)定性相關(guān)的那部分氨基酸，從而使實驗設(shè)計更具針對性。

通過計算機分析為先導再開展實驗，分析和實驗結(jié)果的一致性表明了作者實驗方法的有效性。突變酶比酶活雖有一定的下降，但是具有更高的熱穩(wěn)定性和較好的底物親和力（低的Km值），有很大的應用潛力。

[1]Collins T，Gerday C，F(xiàn)eller G.Xylanases，xylanase families and extremophilic xylanases[J].FEMS Microbiol Rev，2005，29:3-23.

[2]Polizeli M L T M，Rizzatti A C S，Monti R，et al.Xylanases from fungi:properties and industrial applications[J].Appl Microbiol Biotechnol，2005，67:577-591.

[3]Kumar S，Tsai C J，Nussinov R.Factors enhancing protein thermostability[J].Protein Eng，2000，13:179-191.

[4]Dumon C，Varvak A，Wall M A，et al.Engineering Hyperthermostability into a GH11 Xylanase Is Mediated by Subtle Changes to Protein Structure[J].Biol Chem，2008，283:22557-22564.

[5]Xiong H R，F(xiàn)enel F，Leisola M，et al.Engineering the thermostability of Trichoderma reesei endo-1，4-b-xylanase II by combination of disulfide bridges[J].Extremophiles，2004，8:393-400.

[6]Gao S J，Wang J Q，Wu M C，et al.Engineering hyperthermostability into a mesophilic family 11 xylanase from Aspergillus oryzae by in silico design of N-terminus[J].Biotechnol Bioeng，2013，110:1028-1038.

[7]高樹娟，汪俊卿，鄔敏辰，等.N端二硫鍵對11家族木聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響[J].生物工程學報，2012，28:1441-1449.GAO Shu-juan，WANG Jun-qing，WU Mmin-chen，et al.Effect of the N-terminal disulfide bridge on the thermostability of family 11 xylanases[J].Chin J Biotech，2012，28:1441-1449.（in Chinese）

[8]張慧敏，李劍芳，鄔敏辰，等.耐熱木聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達及酶學性質(zhì)[J].食品與生物技術(shù)學報，2013，32:124-128.ZHANG Hui-min，LI Jian-fang，WU Min-chen，et al.Expression of a thermostable xylanase gene in Pichia pastoris and its enzymatic characterization[J].J Food Sci Biotechnol，2013，32:124-128.（in Chinese）

[9]Eswar N，Eramian D，Webb B，et al.Protein structure modeling with Modeller[J].Methods Mol Biol，2008，426:145-159.

[10]朱玉賢，李毅.現(xiàn)代分子生物學（第二版）[M].北京:高等教育出版社，2006.

[11]申艷敏，魏建超，尚書文，等.人源抗菌肽LL-37在畢赤酵母中的高效表達及其活性檢測[J].微生物學通報，2008，35:539-544.SHEN Yan-min，WEI Jian-chao，SHEN Shu-wen，et al.High expression of the human antibacterial peptide LL-37 in Pichia pastoris and the detection of its activity[J].Microbiology，2008，35:539-544.（in Chinese）

[12]王鵬，趙穎，朱平，等.人β-分泌酶（BACE1）在畢赤酵母中分泌表達及純化[J].生物工程學報，2011，27:1655-1666.WANG Peng，ZHAO Yin，ZHU Pin，et al.Expression and purification of human β-secretase （BACE1） in Pichia pastoris[J].Chin J Biotech，2011，27:1655-1666.（in Chinese）