李清宇， 楊 穎， 賈琳斐， 彭 晶， 戴成國(guó)， 段玉峰

（陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710062）

板栗為殼斗科栗屬落葉喬木栗樹(shù)（Castanea mollissima Blume）果實(shí)的種仁[1]。唐代孫思邈《備急千金要方》記載:“栗子，味咸溫?zé)o毒，益氣厚腸胃，補(bǔ)腎氣，令人耐饑，生食之，甚治腰腳不遂”。明代李時(shí)珍《本草綱目》記載:“栗治腎虛、腰腿無(wú)力，能通腎益氣，厚腸胃也，腎主大便，栗能主腎”[2]。板栗不僅含有淀粉、可溶性糖、粗纖維、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸和維生素以及礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分[3-5]，而且還含有糖苷類(lèi)、三萜類(lèi)和酚酸類(lèi)等多種天然產(chǎn)物[6-11]。 研究發(fā)現(xiàn)板栗多糖可以消除體外 O2－·、·OH、NO2－·等多種自由基[12-13]，顯著升高小鼠白細(xì)胞水平和延長(zhǎng)其凝血時(shí)間[14-15]。但板栗多糖研究?jī)H限于分離和單糖組成分析等方面，因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)板栗多糖進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)分析及抗疲勞作用研究，將有利于板栗活性成分及營(yíng)養(yǎng)保健機(jī)理的深入研究，對(duì)板栗制品研發(fā)具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料與試劑

板栗:購(gòu)于陜西省鎮(zhèn)安縣，由陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室鑒定。化學(xué)試劑:均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；血乳酸試劑盒、血尿素氮試劑盒；南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.2 儀器

U-3010 Sdetrophotometer紫外分光光度計(jì):日本HITICHI公司產(chǎn)品；AL204型電子天平:梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；DL-4C低速大容量離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；LGJ-18C冷凍干燥機(jī):北京四環(huán)科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；透析袋:相對(duì)分子質(zhì)量截留8 000～14 000，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 板栗多糖的提取及分離純化

2.1.1 提取流程 參照李潤(rùn)豐等[16]的方法有所改動(dòng):樣品粉末→熱水提取→離心過(guò)濾→上清液→濃縮→醇析→離心過(guò)濾→沉淀→透析→離心過(guò)濾→上清液→冷凍干燥→板栗多糖。

2.1.2 分離純化 多糖分離純化工藝。參照段玉峰等[17]的方法:板栗多糖粗品→DEAE-52纖維素柱層析→洗脫→收集洗脫液→濃縮→真空冷凍干燥→板栗多糖各級(jí)分半純品→SephadexG-100柱層析→洗脫→收集洗脫液→濃縮→真空冷凍干燥→板栗多糖純品。

2.1.3 多糖純度鑒定 利用葡聚糖凝膠SephadexG-100柱層析法[18]進(jìn)行分離純化及純度鑒定。在板栗多糖中加入蒸餾水充分溶解，上柱，用蒸餾水洗脫，洗脫速度0.05 mL/min，每管收集6 mL。隔管利用苯酚-硫酸[19]法檢測(cè)490 nm處吸收峰，以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，收集對(duì)稱(chēng)峰各管。

2.1.4 多糖相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定 測(cè)定板栗多糖相對(duì)分子質(zhì)量選用液相滲透色譜法[19]，選用藍(lán)色葡聚糖和標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)品相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)與保留時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求出板栗多糖的相對(duì)分子質(zhì)量。

2.2 多糖的組成及結(jié)構(gòu)分析

氣相色譜分析稱(chēng)取干燥樣品10 mg，加入2 mL的1 mol/L的H2SO4，抽真空封管，100℃水解12 h，水解液用BaCO3中和過(guò)濾后，真空干燥，然后加入10 mg鹽酸羥胺和1 mL吡啶混勻，90℃水浴反應(yīng)30 min后取出冷卻至室溫，再加入1 mL醋酸酐90℃水浴乙?；磻?yīng)30 min，反應(yīng)物減壓蒸干，用2 mL三氯甲烷充分溶解，按此法分別制備各種標(biāo)準(zhǔn)單糖進(jìn)行氣象色譜分析，結(jié)構(gòu)分析采用紅外光譜法[15]。

2.3 多糖抗疲勞實(shí)驗(yàn)的研究

2.3.1 動(dòng)物分組及給藥 小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、多糖低劑量組 （100 mg/（kg·d））、 以及中劑量組（200 mg/（kg·d））和高劑量組（300 mg/（kg·d）），自由攝食和飲水，連續(xù)灌喂21 d。

2.3.2 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)及力竭游泳時(shí)間的測(cè)定[20]連續(xù)灌胃給藥21 d后開(kāi)始進(jìn)行力竭性游泳實(shí)驗(yàn)。測(cè)定當(dāng)天正常喂食、喂水，小鼠的負(fù)重量約為體質(zhì)量3.0～4.0 g，測(cè)定力竭時(shí)間時(shí)人工驅(qū)趕小鼠不停游泳至完全沒(méi)入水中8～10 s不出水面即可定為力竭，記錄游泳時(shí)間。比較4組的力竭時(shí)間，說(shuō)明補(bǔ)充板栗多糖對(duì)小鼠抗疲勞作用的影響。

2.3.3 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 小鼠連續(xù)灌喂21 d，末次灌喂30 min后，將小鼠置于游泳箱中不負(fù)重游泳90 min，水溫（30±1）℃。游泳前及游泳后25 min眼球取血，測(cè)定小鼠血乳酸（BLA）和游泳后90 min后取眼球血，測(cè)定小鼠血尿素氮（BUN）的含量，小鼠經(jīng)脫頸椎處死后立即取后肌肉和肝臟，生理鹽水沖洗后，用濾紙吸干，按照試劑盒的說(shuō)明，進(jìn)行肌糖原和肝糖原含量的測(cè)定。

3 組成與結(jié)構(gòu)

3.1 板栗多糖粗品的纖維素DEAE-52柱層析

依次使用 0.1，0.2 mol/L的 NaCl進(jìn)行梯度洗脫，繪制洗脫曲線見(jiàn)圖1。

圖1 0.1，0.2 mol/L的NaCl進(jìn)行梯度洗脫曲線Fig.1 Elution curve by 0.1，0.2 mol/L NaCl on DEAE-52 Colum

由圖1可知，板栗多糖粗品在DEAE-52纖維素柱上用0.1 mol/L NaCl洗脫可達(dá)到有效分離，收集13～25管洗脫液，濃縮、真空冷凍干燥為白色絮狀物，得到0.809 6 g板栗多糖CPS-1。板栗多糖粗品在DEAE-52纖維素柱上用0.2 mol/L NaCl洗脫可達(dá)到有效分離，收集37～55管洗脫液，濃縮、真空冷凍干燥為白色絮狀物，得到1.071 4 g板栗多糖CPS-2。

3.2 板栗多糖的純度鑒定

3.2.1 板栗多糖葡聚糖凝膠SephadexG-100柱層析為了得到單一的多糖組分，采用葡聚糖凝膠SephadexG-100柱層析法對(duì)經(jīng)纖維素DEAE-52柱層析法分離得到CPS-1、CPS-2進(jìn)一步分離純化和純度鑒定，選用蒸餾水作為洗脫劑，CPS-1、CPS-2在SephadexG-100層析柱上的洗脫曲線如圖2所示。

圖2 CPS-a、CPS-b在SephadexG-100層析柱上的洗脫曲線Fig.2 Elution curve of CPS-a，CPS-b on SephadexG-100 column

由圖2可知，纖維素DEAE-52柱層析法分離得到CPS-1在SephdexG-100柱層析時(shí)得到單一對(duì)稱(chēng)的洗脫峰，收集對(duì)稱(chēng)峰位置，經(jīng)濃縮、真空冷凍干燥得板栗多糖純品CPS-a。經(jīng)纖維素DEAE-52柱層析法分離得到CPS-2在SephdexG-100柱層析時(shí)得到單一對(duì)稱(chēng)的洗脫峰，收集對(duì)稱(chēng)峰位置，經(jīng)濃縮、真空冷凍干燥得板栗多糖純品CPS-b。

3.2.2 板栗多糖的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法中的色譜條件，取標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣并記錄洗脫峰保留時(shí)間。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值，橫坐標(biāo)為相應(yīng)峰的保留時(shí)間，進(jìn)過(guò)線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為:lgMw=-0.554 5RT＋8.969 9，式中Mw為平均相對(duì)分子質(zhì)量，RT為保留時(shí)間（單位:min），相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3。根據(jù)線性回歸方程計(jì)算得CPS-a和CPS-b的平均相對(duì)分子質(zhì)量分別為34 500和52 100。

3.3 板栗多糖的組成及結(jié)構(gòu)分析

氣相色譜分析結(jié)果:混合標(biāo)準(zhǔn)品單糖的氣象色譜圖如圖3所示，CPS-a和CPS-b中的單糖氣相色譜圖如圖4和5所示。

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)品單糖的氣相色譜圖Fig.3 GC of the mixed standard monosacharides

混合標(biāo)準(zhǔn)品單糖的氣相色譜圖中單糖與主要色譜峰的對(duì)應(yīng)關(guān)系:阿拉伯糖為4.187，鼠李糖為4.205，核糖為 4.55、4.718，木糖為 5.182，甘露糖為6.282，果糖為6.403，半乳糖為6.812，山梨糖為6.855，葡糖糖為7.115。

由圖4可知，CPS-a主要由葡萄糖∶甘露糖∶木糖∶阿拉伯糖=7.123∶6.281∶5.036∶4.19。 由圖 5 可知，CPS-b主要由葡萄糖∶果糖∶甘露糖∶木糖∶阿拉伯糖=7.123∶6.423∶6.289∶5.053∶4.19。

圖4 CPS-a水解物氣相色譜圖Fig.4 GC of Hydrolysates of CPS-a

圖5 CPS-b水解物氣相色譜圖Fig.5 GC of Hydrolysates of CPS-b

3.4 板栗多糖的紅外光譜分析結(jié)果

CPS-a和CPS-b的紅外光譜分析結(jié)果如圖6和圖7所示。

圖6 CPS-a紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrogram of CPS-a

圖7 CPS-b紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectrogram of CPS-b

由圖可知，CPS-a 和 CPS-b 在 3 400、2 900、1 640、1 400、1 075～1 000 cm-1附近區(qū)域都有吸收峰，這些區(qū)域的吸收峰都是多糖的特征吸收峰。3 600～3 200 cm-1出現(xiàn)的寬峰是分子內(nèi)和分子間的O-H的伸縮振動(dòng)，吸收峰寬是由于分子內(nèi)羥基之間形成氫鍵；2 900 cm-1附近吸收峰是由于C-H伸縮振動(dòng)引起；1 640 cm-1附近吸收峰是C=O伸縮振動(dòng)和NH變角振動(dòng)；C-H變角振動(dòng)引起1 400 cm-1附近吸收峰；1 075～1 000 cm-1附近的吸收峰說(shuō)明CPS-a、CPS-b都含有吡喃環(huán)；1 250～980 cm-1間較大的吸收峰是由C-O的伸縮振動(dòng)引起，其中一種是C-OH，另一種為C-O-C。CPS-a在931 cm-1附近吸收峰是呋喃糖衍生物A型吸收，853 cm-1附近吸收峰是呋喃糖衍生物C型吸收。CPS-b在1 354 cm-1、1 273 cm-1附近的吸收峰都是S=O伸縮振動(dòng)引起，分別是磺?；土蛩峄砻鞔颂擎溈赡苁橇蛩峄嗵?，915、857、764 cm-1附近的吸收峰表明糖鏈中同時(shí)存在 α-、β-糖苷鍵。

4 抗疲勞實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

4.1 小鼠負(fù)重游泳力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1可以看出，各劑量組的游泳時(shí)間均高于對(duì)照組，除低劑量組以外，中劑量組和高劑量組與對(duì)照組比均達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著水平 （p＜0.05，p＜0.01），分別比對(duì)照組游泳時(shí)間增加了27%和44%，說(shuō)明板栗多糖可以提高小鼠的耐力，具有抗疲勞的效果。

表1 板栗多糖對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響Table 1 Effect on the swimming time

4.2 小鼠血乳酸（BLA）和血尿素氮（BUN）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，游泳前各劑量組與對(duì)照組的血乳酸含量無(wú)明顯差異，游泳25 min后3個(gè)給藥劑量組的血乳酸含量明顯低于對(duì)照組（p＜0.05，p＜0.01），中劑量組和高劑量組中血乳酸的濃度與對(duì)照組相比降低更加明顯。靜息期各劑量組與對(duì)照組的血尿素氮含量無(wú)太大差別，游泳90min后，對(duì)照組小鼠血尿素氮含量增加了43%，顯著高于各計(jì)量組 （p＜0.05，p＜0.01）。

表2 板栗多糖對(duì)血乳酸和血尿素氮濃度的影響Table 2 Effect on BLA and BUN content in swimming

由表3可知，低劑量組在游泳前后，肌糖原和肝糖原都無(wú)顯著的變化，中劑量組和高劑量組對(duì)小鼠游泳前后的肌糖原和肝糖原影響都很顯著 （p＜0.05，p＜0.01）。

表3 板栗多糖對(duì)肌糖原和肝糖原質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Table 3 Effect on glycogen in mice

5 結(jié)語(yǔ)

1）實(shí)驗(yàn)分離得到的板栗多糖CPS-a與楊利劍等[15]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，即板栗多糖的單糖組分為阿拉伯糖，甘露糖，木糖和葡萄糖。何玲玲等[12]研究表明是在紅外譜圖4 000～400 cm-1區(qū)間出現(xiàn)的吸收峰為多糖類(lèi)物質(zhì)的一般特征吸收峰。而本實(shí)驗(yàn)分離得到的板栗多糖CPS-a與何玲玲等實(shí)驗(yàn)所得CPS1為同一物質(zhì)。

2）糖原是運(yùn)動(dòng)中最重要的能源物質(zhì)，機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)后大量產(chǎn)生糖原被消耗，因此糖原儲(chǔ)備可作為評(píng)價(jià)機(jī)體抗疲勞的重要指標(biāo)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以看出，板栗多糖對(duì)小鼠力肝糖原和肌糖原均有著顯著而積極的影響，從而延緩疲勞的出現(xiàn)。

通過(guò)測(cè)試小鼠的劇烈運(yùn)動(dòng)后血乳酸和血尿素氮的含量可以看出，運(yùn)動(dòng)后，低、中、高計(jì)量給藥組明顯低于對(duì)照組說(shuō)明板栗多糖可以加速過(guò)多乳酸的清除代謝，減少乳酸的產(chǎn)生并加速運(yùn)動(dòng)后乳酸的清除，從而延緩疲勞的發(fā)生。

研究表明機(jī)體血尿素含量變化可說(shuō)明體內(nèi)含氮物質(zhì)分解狀態(tài)，也是評(píng)價(jià)機(jī)體在特殊條件下體力勞動(dòng)負(fù)荷承受能力的一個(gè)較靈敏的指標(biāo)。機(jī)體血尿素氮含量隨勞動(dòng)及運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的增加而增加，機(jī)體對(duì)負(fù)荷的適應(yīng)能力越差，血尿素氮的增加就越明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，游泳后低、中、高劑量組血尿素氮的含量明顯低于對(duì)照組，提示板栗多糖能夠是小鼠的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷能力提高，不易發(fā)生疲勞。

總體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明板栗多糖能夠延緩疲勞的產(chǎn)生和加速疲勞的消除，并且中劑量組200 kg/（mg·d）的效果最明顯，高劑量組并無(wú)明顯效果。

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