唐自鐘， 劉 姍， 韓學(xué)易， 姚友旭， 劉默洋，陳 惠，晉海軍， 吳 琦， 單 志

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與理學(xué)院，四川 雅安625014）

近年來(lái)，隨著纖維素在生產(chǎn)糖、工業(yè)酒精、生物質(zhì)能源替代等應(yīng)用領(lǐng)域的飛速發(fā)展，纖維素酶的市場(chǎng)前景和應(yīng)用價(jià)值更加廣闊了。雖然天然纖維素酶種類(lèi)較多，但由于其催化活性低、生產(chǎn)成本高以及催化條件苛刻等因素，真正能夠用于工業(yè)生產(chǎn)的卻很少。幾十年來(lái)通過(guò)傳統(tǒng)的誘變育種技術(shù)已獲得許多纖維素酶高產(chǎn)菌株，已用于大規(guī)模生產(chǎn)，但它們的產(chǎn)酶能力還遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了日益增大的市場(chǎng)需求[1]。高成本、低酶活已成為制約纖維素酶廣泛應(yīng)用的兩大瓶頸，通過(guò)基因工程及蛋白質(zhì)工程在分子水平上對(duì)纖維素酶基因進(jìn)行改造，構(gòu)建高效表達(dá)高活性纖維素酶的基因工程菌，降低纖維素酶生產(chǎn)成本和實(shí)用性，成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。

天然中性或堿性纖維素酶雖然種類(lèi)較多，但是真正能夠用于工業(yè)生產(chǎn)的卻很少，很多纖維素酶雖然最適pH為堿性，但是酶活太低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)應(yīng)用的要求。近年來(lái)一些學(xué)者通過(guò)分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程等手段對(duì)其進(jìn)行定向進(jìn)化，并達(dá)到了一定預(yù)期效果，為在分子水平和蛋白水平上解釋纖維素酶的作用機(jī)理以及進(jìn)一步改良纖維素酶的催化特性奠定了理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。定向進(jìn)化技術(shù)是通過(guò)人為創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬天然進(jìn)化機(jī)制，在體外對(duì)基因進(jìn)行廣泛的突變，從一個(gè)或多個(gè)人工突變酶庫(kù)中通過(guò)一定篩選或選擇方法最終獲得預(yù)先期望的具有某些特性的進(jìn)化酶[2]。易錯(cuò)PCR以其操作簡(jiǎn)便、有效等優(yōu)點(diǎn)成為目前應(yīng)用最為廣泛的進(jìn)化手段之一[3]。近幾年來(lái)，有關(guān)內(nèi)切葡聚糖酶定向進(jìn)化的研究報(bào)道較多，主要集中在最適pH和熱穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì)改造方面[4-6]，酶活性提高方面也有報(bào)道[7-9]。作者通過(guò)定向進(jìn)化策略對(duì)來(lái)自枯草芽胞桿菌C-36的中性內(nèi)切葡聚糖酶基因（GenBank Accession No:DQ782954）進(jìn)行定向進(jìn)化，通過(guò)高通量篩選手段獲得了高酶活的的突變體，并對(duì)獲得的突變體酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模建，分析了酶三級(jí)結(jié)構(gòu)變化與酶活之間的關(guān)系以及最佳突變株的蛋白表達(dá)情況和酶的酶學(xué)性質(zhì)。同時(shí)，獲得的內(nèi)切葡聚糖酶基因可進(jìn)一步在酵母，芽胞桿菌等高表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，獲得可以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 菌株與載體列于表1。

表1 菌株與載體Table 1 Strains and vectors

1.1.2 酶和試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶:購(gòu)自大連寶生物公司；DNA marker:購(gòu)自天根生化科技有限公司；PCR純化試劑盒及質(zhì)粒純化試劑盒:購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；MnCl2:購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為進(jìn)口試劑或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 易錯(cuò)PCR擴(kuò)增及突變體庫(kù)的構(gòu)建 根據(jù)已知的枯草胞芽桿菌（B.subtilis）C-36的內(nèi)切葡聚糖酶基因（GenBank Accession No:DQ782954）去除信號(hào)肽的部分設(shè)計(jì)引物:Upstream primer:（5’-TAATCCAACCCGGAATTCGCAGAGACAAAAACGC CAGTAGC-3’） Downstream primer:（5’TAGGAAAG GAAAAAAGCGGCCGCCTAATTTGGTTCTGTTCCCC AAA-3’），由上海英駿公司合成，擴(kuò)增的片段大小為1 413 bp。

以質(zhì)粒pMD19-T-Cen為模板，反應(yīng)體系為:14 μL 25 mmol/L MgCl2；5 μL 10xTaq PCR buffer；5 μL 10 X易錯(cuò) dNTP混合物 （2 mmo/L dGTP，2 mmol/L dATP ，10 mmol/L dCTP和 10 mmol/L dTTP）； 引物各 30 pmol；0.5 μL 的 10 mmol/L MnCl2； 模 板 20 pmol；Taq DNA聚合酶為2.5 U，超純水至總體積為50 μL。PCR程序?yàn)?95℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，51 ℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，30個(gè)循環(huán)后，72℃ 延伸10 min，16℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳后，純化回收目的條帶。純化后的產(chǎn)物和pET32a載體經(jīng)EcoR I和 Not I雙酶切過(guò)夜后回收，載體回收5.9 kb片段，目的基因回收1.4 kb片段，回收后的產(chǎn)物按比例混合后加入T4 DNA連接酶連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布固體LB（含100 μg/mL的Amp）平板，抗性篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，此即構(gòu)建好的內(nèi)切葡聚糖酶基因突變體庫(kù)。

1.2.2 陽(yáng)性克隆的初篩及鑒定 將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)劃線的LB固體培養(yǎng)基 （含100 μg/mL氨芐青霉素）上面（P1），并同時(shí)復(fù)制到另一個(gè)含有CMC-Na并加入IPTG終濃度為1 mmol/L誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基（P2）上面，P1平板37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取P1平板上面的菌株用pET32a的通用引物T7進(jìn)行菌落PCR鑒定。將P2平板37℃培養(yǎng)3 d進(jìn)行剛果紅染色篩選。用剛果紅染色法篩選出水解圈較大的轉(zhuǎn)化子，初步鑒定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。挑取水解圈較大的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種到10 mL LB液體培養(yǎng)基 （含100 μg/mL氨芐青霉素）37℃，170 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種至25 mL培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至A值為0.6～0.8，為加入IPTG使其終濃度1 mmol/L誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h。酶活的測(cè)定，將25 mL菌液，4℃，4 000 r/min離心10 min，磷酸鹽緩沖液1 mL（1/15 mol/L pH 6.81）重懸菌體，超聲破碎裂解細(xì)胞，裂解液8 000 r/min離心10 min，取上清液一定比例稀釋后作為粗酶液測(cè)定酶活力。并在相同條件下測(cè)定原始菌和突變株，重復(fù)測(cè)定3次，每次2個(gè)平行，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

酶活測(cè)定參照農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)略做改進(jìn)[10]。以1 mL 0.8%的羧甲基纖維素鈉 （用1/15 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液配制）為底物，加入1 mL粗酶液，50℃水浴反應(yīng)30 min后，加入2.5 mL DNS顯色液，沸水浴煮5 min，取出后在流水下迅速冷卻后定容至25 mL搖勻，在540 nm處測(cè)定吸光值。在此實(shí)驗(yàn)條件下，1 mL酶液每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量作為1個(gè)酶活單位，用U/mL表示。

1.2.3 突變基因序列分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和突變位點(diǎn)分析 高酶活力突變株P(guān)CR及酶切驗(yàn)證正確后送上海英駿公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，找出突變堿基位點(diǎn)和氨基酸突變。通過(guò)在線分子建模系統(tǒng)SWISS-MODEL（http://swissmode1.expasy.org/）預(yù)測(cè)內(nèi)切葡聚糖酶成熟蛋白的三維結(jié)構(gòu)[11]根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)信息，運(yùn)用DeepView （Swiss-PdbViewer Version 4.0）軟件分析突變位點(diǎn)的突變效應(yīng)。

1.2.4 突變株內(nèi)切葡聚糖酶的SDS-PAGE分析取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌懸液及不含有內(nèi)切葡聚糖酶基因的空載體菌懸液，按測(cè)酶活的方法處理獲得粗酶液，取粗酶液加入2×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液混勻，沸水浴處理3～5 min，冷卻，離心后用于 SDSPAGE凝膠進(jìn)行凝膠電泳分析，操作過(guò)程見(jiàn)文獻(xiàn)[12]。

1.2.5 突變株F-10內(nèi)切葡聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析

1）突變株F-10內(nèi)切葡聚糖酶的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性 以1 mL不同pH值的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液為底物，測(cè)定酶活，確定酶的最適反應(yīng)pH。將原酶液置于不同pH值的緩沖液于50℃保溫30 min，在最適pH值條件下測(cè)定殘余酶活力從而測(cè)定pH穩(wěn)定性[13]。

2）突變株F-10內(nèi)切葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性 在最適反應(yīng)pH環(huán)境下，將適當(dāng)稀釋的酶液分別在不同溫度梯度下測(cè)定酶活，確定酶的最適反應(yīng)溫度。將適當(dāng)稀釋的酶液置于相對(duì)穩(wěn)定的pH值，分別在不同溫度梯度下保溫30 min，再在50℃測(cè)定殘余酶活力[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 易錯(cuò)PCR擴(kuò)增及突變體庫(kù)的構(gòu)建

一般易錯(cuò)PCR的過(guò)程中都要提高M(jìn)g2+濃度，并加入Mn2+，以提高PCR過(guò)程中的突變率。通過(guò)調(diào)整兩種離子的濃度，可以獲得合適突變頻率的多樣性文庫(kù)。經(jīng)過(guò)條件的初步摸索，最終確定加入終濃度為 7 mmol/L Mg2+和0.5 mmol/L Mn2+為最適的突變條件。終濃度為7 mmol/L Mg2+和0.5 mmol/L Mn2+為最適的突變條件。擴(kuò)增得到中性內(nèi)切葡聚糖酶基因片段為1 400 bp的條帶，如圖1

圖1 易錯(cuò)PCR的電泳圖Fig.1 Patterns of error-prone PCR

PCR純化產(chǎn)物和pET32a（+）載體分別經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切過(guò)夜純化回收后16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 （DE3）， 含100 μg/mL的Amp平板抗性篩選后獲得易錯(cuò)PCR轉(zhuǎn)化子2 000～3 000株，所有轉(zhuǎn)化子構(gòu)成內(nèi)切葡聚糖酶基因突變體庫(kù)。

2.2 陽(yáng)性克隆的初篩及鑒定

利用通用引物T7進(jìn)行菌落PCR結(jié)果顯示每一個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增出1 400 bp的條帶，說(shuō)明其中性內(nèi)切葡聚糖酶基因已成功導(dǎo)入到BL21菌株中，對(duì)P2平板誘導(dǎo)3 d后進(jìn)行1 mg/mL的剛果紅溶液，染色30 min，再用1 mol/L的NaCl溶液洗滌多次。若轉(zhuǎn)化子具有酶活性，則菌落周?chē)鷷?huì)出現(xiàn)清晰的淡黃色透明圈，透明圈直徑與菌落直徑的比值越大說(shuō)明轉(zhuǎn)化子酶活越高[14]，如圖2。篩選得到一株高酶活的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，命名為F-10。

挑取F-10突變體，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，并將原始菌進(jìn)行同時(shí)誘導(dǎo)培養(yǎng)，經(jīng)超聲波破碎后利用上清測(cè)酶活，結(jié)果見(jiàn)表2。其羧甲基纖維素鈉水解活力分別為（4.2±0.13）U/mL，該突變株平均酶活相比野生型內(nèi)切葡聚糖酶的 （0.98±0.10）U/mL分別提高了4.2倍（表 2）。

2.3 突變基因序列分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和突變位點(diǎn)分析

突變基因的序列分析見(jiàn)表3，F(xiàn)-10基因共有5個(gè)堿基發(fā)生了突變，其中有3個(gè)是轉(zhuǎn)換，只有2個(gè)是顛換，3個(gè)轉(zhuǎn)換也均發(fā)生在A、T之間，2個(gè)顛換也均發(fā)生在A、G之間。

圖2 剛果紅平板篩選結(jié)果Fig.2 Screening result in Congo red staining plates

表2 相對(duì)酶活性Table 2 Relative enzymatic activity

表3 突變體的測(cè)序結(jié)果Table 3 Sequencing results of the mutants

運(yùn)用并Swiss-model模擬內(nèi)切葡聚糖酶的三維空間模型，分別以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中的Bacillus agaradhaerens纖 維 素 催 化 結(jié) 構(gòu) 域 （7a3h）和Clostridium cellulolyticum的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（1G43）為模型，模擬出內(nèi)切葡聚糖酶的催化結(jié)構(gòu)域（cellulase domain，CD）和結(jié)合結(jié)構(gòu)域（carbohydratebinding domain，CBD）的三維結(jié)構(gòu)圖，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示枯草芽胞桿菌內(nèi)切葡聚糖酶的催化結(jié)構(gòu)域包含294個(gè)氨基酸殘基（aa36-329），屬于糖基水解酶第五家族，具有典型的 （β/α）8桶狀結(jié)構(gòu)；結(jié)合結(jié)構(gòu)域含146個(gè)氨基酸殘基（aa354-499），具有碳水化合物結(jié)合域第三家族的特征，為數(shù)條β折疊片形成的三明治結(jié)構(gòu)。

用 DeepView （Swiss-PdbViewer Version 4.0）軟件分析模擬的三維結(jié)構(gòu)信息，可知F-10突變酶的突變位點(diǎn)位于成熟蛋白的催化結(jié)構(gòu)域（CD）212位。對(duì)催化結(jié)構(gòu)域三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析表明在212位D212V的突變使酶三級(jí)結(jié)構(gòu)氫鍵改變，從而使酶蛋白剛性降低，引起該部位相關(guān)氨基酸殘基側(cè)鏈柔性增加，從而更加有助于底物向活性部位靠近，促成酶催化效率的提高。T307S突變發(fā)生在連接區(qū)，此變化有可能增加連接區(qū)蛋白的柔性，使酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域更容易靠近，使酶的催化效率提高，見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 原始酶212位天冬氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Endoglucanase 212ASP chemical structure

圖4 突變株f-10酶212位纈氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.4 Mutated 212VAL chemical structure

2.4 突變株內(nèi)切葡聚糖酶的SDS-PAGE分析

圖 5中泳道 1，2，3，4依次為: 轉(zhuǎn)入 pET32a空質(zhì)粒的BL21菌株，原始菌株，突變株F-10 1，2破壁產(chǎn)物依照超聲波破碎方法分別對(duì)重組大腸桿菌pET-C36的細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，如圖5所示，其相對(duì)分子量為73 000，與理論計(jì)算大小相符（載體pET-32α中硫氧還原蛋白的大小約為20 000）。另外，在含空載體大腸桿菌的細(xì)胞裂解物中，不存在大小約73 000的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。而且F-10表達(dá)量明顯多于原始酶。

圖5 酶表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of expression of endoglucanase gene in E.coil BL21

2.5 突變株F-10酶學(xué)性質(zhì)分析

2.5.1 突變株F-10酶的最適反應(yīng)pH 以不同pH值的緩沖液配置底物（CMC-Na），取不同pH值的底物與適當(dāng)稀釋的酶液50℃條件下反應(yīng)30 min，測(cè)得不同pH值下的酶活力。重復(fù)測(cè)定3次結(jié)果表明:該突變體的最適反應(yīng)pH值為5.6。而在pH 4～4.6時(shí)酶活力迅速降低，在pH 8.4～10時(shí)酶活可維持最高酶活的60%。該酶反應(yīng)的pH值具有較寬范圍，即在pH 4.6～8.0范圍內(nèi)酶活可達(dá)最高酶活的70%以上，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 突變酶的最適反應(yīng)pH值Fig.6 Optimal reaction pH of mutation endoglucanase

2.5.2 突變株F-10酶的pH穩(wěn)定性 將酶液置于不同pH值的緩沖液于50℃保溫30 min，測(cè)定剩余酶活力，以最高酶活作為100%，重復(fù)測(cè)定3次，測(cè)得不同pH處理下的酶活力（圖7）。結(jié)果表明:內(nèi)切葡聚糖酶在pH 4～5的緩沖溶液中50℃處理30 min后相對(duì)酶活力迅速降低，而當(dāng)pH 5～10時(shí)，酶活力相對(duì)穩(wěn)定，可保持在最高酶活的80%以上。

2.5.3 突變株F-10酶的最適反應(yīng)溫度 在pH 6.8條件下， 將酶液分別在 40、45、50、55、60、65、70、75℃環(huán)境下與底物反應(yīng)30 min后測(cè)定酶活力（圖8）。結(jié)果表明:該酶反應(yīng)溫度有45℃和65℃兩個(gè)峰值，最適反應(yīng)溫度為45℃，在40～70℃范圍內(nèi)酶活可維持在最高酶活的60%以上，當(dāng)溫度大于75℃時(shí)，酶迅速失活。

圖7 突變酶的pH穩(wěn)定性Fig.7 EffectofpH on the stability ofmutation endoglucanase

圖8 突變酶的最適反應(yīng)溫度Fig.8 Optimal reaction temperature of endoglucanase

2.5.4 突變株F-10酶的熱穩(wěn)定性 將酶液分別置于 60、65、70、75、80、85、90 ℃環(huán)境下保溫 5 min，再于50℃測(cè)定殘余酶活力，以最高酶活作為100%（圖9）。結(jié)果表明:內(nèi)切葡聚糖酶在70℃處理5 min后酶活力最高，當(dāng)溫度高于75℃時(shí)，酶開(kāi)始變性失活，酶活力迅速下降。在60～75℃酶活力相對(duì)穩(wěn)定，可保持在最高酶活的80%以上。

圖9 突變酶的熱穩(wěn)定性Fig.9 Effectoftemperatureonthestabilityofendoglucanase

比較原始酶 （最適溫度為65℃，最適pH為6.0），突變酶的最適溫度和最適pH都發(fā)生了變化，酶反應(yīng)溫度有45℃和65℃兩個(gè)峰值，最適反應(yīng)溫度為45℃這有利于突變酶在實(shí)際中的應(yīng)用，突變酶能在低溫下更好的發(fā)揮作用；節(jié)約能源。突變酶的最適pH偏向于酸性，增大了酶的作用范圍。突變酶的熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性，沒(méi)發(fā)生太大的變化。而在堿性范圍內(nèi)廣泛的pH穩(wěn)定性和高酶活有利于該酶在工業(yè)中的實(shí)際應(yīng)用。

3 討論

作者自主篩選到一株高產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的枯草芽胞桿菌，并克隆出該基因，但原始酶存在酶活性不高等問(wèn)題。采用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)此基因進(jìn)行定向進(jìn)化，在分子水平上改造了該酶，篩選得到酶活性提高的突變株。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變大多發(fā)生在A、T、G核苷酸之間，而且突變中轉(zhuǎn)換多于顛換，表明易錯(cuò)PCR方法介導(dǎo)的突變具有一定的偏向性，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[15]。

定向進(jìn)化中，往往有益突變只占所有突變子的一小部分，從有大量突變株的突變體庫(kù)中篩選有益克隆是一項(xiàng)非常繁瑣的工作，這需要高通量、高靈敏度方法的建立。作者采用的剛果紅平板染色法[16]簡(jiǎn)單可行，而且靈敏度、準(zhǔn)確性及可重復(fù)性都較好，不需要昂貴的儀器設(shè)備，是內(nèi)切葡聚糖酶體外定向進(jìn)化高通量的篩選的有效方法。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):此篩選方法中，平板形成的水解圈大小和酶活性高低成一定的正相關(guān)。合適的誘導(dǎo)劑濃度和合理的培養(yǎng)時(shí)間是高通量篩選的關(guān)鍵，誘導(dǎo)劑濃度過(guò)大或培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使產(chǎn)生的水解圈重合，給篩選帶來(lái)不便，濃度過(guò)小或培養(yǎng)時(shí)間太短會(huì)導(dǎo)致酶未充分表達(dá)，水解圈不明顯。 內(nèi)切葡聚糖酶成熟蛋白由一個(gè)長(zhǎng)82aa的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域CBM和一個(gè)長(zhǎng)253aa的催化結(jié)構(gòu)域CD組成，中間有55aa連接肽（Linker）的連接區(qū)?？莶菅堪麠U菌內(nèi)切葡聚糖酶屬于糖基水解酶第五家族，第五家族糖基水解酶含有一些非常保守且空間位置相近的氨基酸殘基位點(diǎn)，其中169位谷氨酸和257位谷氨酸是酶催化過(guò)程的主要活性殘基[17-19]。突變酶F-10的兩個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)分別位于催化結(jié)構(gòu)域和連接區(qū)。其中D212V突變導(dǎo)致結(jié)構(gòu)域此位點(diǎn)形成的氫鍵減少，氫鍵的變化可能有利于酶的柔性，增加酶的催化效率。此外由酸性的天冬氨酸突變?yōu)橹行缘睦i氨酸，導(dǎo)致催化結(jié)構(gòu)域此位點(diǎn)電荷性質(zhì)發(fā)生變化，使酶活發(fā)生變化。T307S突變發(fā)生在連接區(qū)，此突變氨基酸側(cè)鏈并未發(fā)生太大變化，減少一個(gè)甲基，此變化有可能增加連接區(qū)蛋白的柔性，使酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域更容易靠近，使酶的催化效率提高。目前關(guān)于第五家族內(nèi)切葡聚糖酶基因結(jié)合結(jié)構(gòu)域的報(bào)道較少，主要在其與催化域的活性和穩(wěn)定性的關(guān)系[20-21]，作者獲得一株結(jié)合結(jié)構(gòu)域突變而酶活性提高的菌株，說(shuō)明結(jié)合結(jié)構(gòu)域與內(nèi)切葡聚糖酶酶活性有關(guān)系，對(duì)其深入的研究將有助于對(duì)纖維素酶催化原理的進(jìn)一步闡明，為纖維素酶的分子改造提供理論指導(dǎo)。

SDS-PAGE分析表明，同等培養(yǎng)條件下，突變酶的表達(dá)量明顯地提高，表現(xiàn)為條帶增粗，這可從密碼子優(yōu)化來(lái)闡明:枯草芽孢桿菌編碼甘氨酸時(shí)GGA為偏愛(ài)密碼子，而大腸桿菌中GGA則為稀有密碼子。測(cè)序結(jié)果顯示，兩個(gè)無(wú)義突變（277 GGAGGG甘氨酸 、417GGA–GGT甘氨酸）優(yōu)化了大腸桿菌的稀有密碼子，所以導(dǎo)致在大腸桿菌中表達(dá)量的變化，表現(xiàn)為酶活的提高。

內(nèi)切葡聚糖酶的改造國(guó)內(nèi)外近年來(lái)研究報(bào)道較多，Wang等對(duì)里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行定向進(jìn)化，獲得了一株最適pH提高了0.6的突變體[4]，Liu等對(duì)來(lái)自 Clostridium phytofermentans的內(nèi)切葡聚糖酶Cel5A進(jìn)行了定向進(jìn)化，篩選得到CMC酶活在60℃半衰期分別提高92%、36% 和46%的突變株[6]。Kim等人通過(guò)LB-Amp-IPTG平板方法篩選纖維素酶的突變庫(kù)，獲得提高5.0倍和2.2倍的突變株[9]。林凌等通過(guò)易錯(cuò)PCR和DNA Shfulling技術(shù)對(duì)來(lái)自枯草芽胞桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行了定向進(jìn)化，獲得了酶活性分別提高2.68和2.03倍的突變體，并對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶的三維結(jié)構(gòu)與酶活性關(guān)系做了分析[18]。作者通過(guò)體外定向進(jìn)化技術(shù)，通過(guò)一輪易錯(cuò)PCR，獲得了內(nèi)切葡聚糖酶催化活性分別提高4.2倍的突變株，更重要的是，關(guān)于內(nèi)切葡聚糖酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域的研究為進(jìn)一步闡明纖維素酶的催化機(jī)理積累了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)也為構(gòu)建高效表達(dá)基因工程菌用于中性內(nèi)切葡聚糖酶酶工業(yè)化生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)材料。

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