徐麗廣， 劉麗強(qiáng)， 匡 華， 彭池方， 宋珊珊， 歐陽(yáng)華， 胥傳來(lái)

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

2008年的“三鹿”奶粉事件導(dǎo)致30多萬(wàn)嬰兒住院，是我國(guó)近年來(lái)出現(xiàn)的最嚴(yán)重的食品安全事件，嚴(yán)重?fù)p害了我國(guó)食品制造的國(guó)際聲譽(yù)，給我國(guó)乳制品產(chǎn)業(yè)造成了前所未有的重大損失[1-3]。不法分子利用傳統(tǒng)凱氏定氮檢測(cè)方法的漏洞，在生乳中添加工業(yè)原料三聚氰胺來(lái)獲得較高的“表觀蛋白質(zhì)”水平，導(dǎo)致劣質(zhì)有害奶粉的大量生產(chǎn)[4]。三聚氰胺已被證實(shí)可引起嬰兒腎結(jié)石，各個(gè)國(guó)家和政府組織均制訂了乳制品中該物質(zhì)的最大殘留限量。我國(guó)規(guī)定，乳制品中三聚氰胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得高于2.5 mg/kg，嬰幼兒乳品中的最大質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得高于1 mg/kg。相應(yīng)地，我國(guó)出臺(tái)了三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法（GB/T 22388）。目前報(bào)道的檢測(cè)方法也多基于色譜和質(zhì)譜的檢測(cè)方法。這些方法需要復(fù)雜的前處理，從提取到凈化耗費(fèi)大量的有機(jī)溶劑和固相萃取小柱[5-9]。

快速高效的樣品前處理技術(shù)可以大大簡(jiǎn)化和加快檢測(cè)流程。免疫親和層析柱，是基于抗體或抗原大分子的綠色前處理手段，可以集提取和凈化于一身，無(wú)需大量有毒有害溶劑，而且可以多次重復(fù)使用，因而越來(lái)越受到分析人員的青睞[10-13]。作者以三聚氰胺單克隆抗體做為識(shí)別體，裝填了具有高柱容量的親和層析小柱。目前對(duì)于三聚氰胺分離富集免疫層析小柱的報(bào)道尚未看到，將為食品中三聚氰胺的檢測(cè)提供了新的前處理手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三聚氰胺抗體，作者所在實(shí)驗(yàn)室自制，半數(shù)抑制率（IC50）為6 ng/g，與三聚氰胺親和常數(shù)為2.67×109L/mol，與除了與滅蠅胺的交叉反應(yīng)為132%外，與其他三聚氰胺類似物無(wú)交叉反應(yīng)。四甲氧基硅烷（TMOS）和 PEG400:購(gòu)自 Sigma（上海）貿(mào)易有限公司；三聚氰胺及其他試劑:購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑總公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平AB104-N型:購(gòu)自上海Metller Toledo Group；精密酸度計(jì)PHS-3TC型:購(gòu)自上海天達(dá)儀器有限公司；紫外掃描儀U-3000型:購(gòu)自日本島津公司；可見(jiàn)分光光度計(jì)722型:購(gòu)自上海分析儀器廠；高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC/MS）LCQDECA型:美國(guó)非尼根公司產(chǎn)品；WH-2微型旋渦混合儀和HPD-25D真空泵:購(gòu)自上海滬西分析儀器廠；可調(diào)試移液器:購(gòu)自美國(guó)熱電公司。

1.3 溶液配制

磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.4）配制參考文獻(xiàn)方法[14]。淋洗液為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%Tween-20的0.02 mol/L PBS溶液；上樣溶液為含體積分?jǐn)?shù)10%甲醇的0.02 mol/LPBS溶液；洗脫溶液為含有體積分?jǐn)?shù)50%甲醇的0.01 mol/L pH 3.5甘氨酸-鹽酸溶液（稱取甘氨酸7.5 g，加入12 mol/L HCl 10 mL，甲醇500 mL，純水定容至1 000 mL）。再生液為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%Tween-20的0.01 mol/L的PBS溶液。

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:稱量0.1 g的三聚氰胺藥品，用磷酸鹽緩沖液溶解定容至1 000 mL，即為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用上樣緩沖液將100 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋配成質(zhì)量濃度為50、25、10、5、2.5、1 μg/mL，500、250、100、50、25、10、5、2.5、1、0 ng/mL。每個(gè)質(zhì)量濃度配成100 mL，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 IAC柱制備

量取抗體溶液，用 PBS（0.01 mol/L pH 7.4）緩沖液稀釋至1 mg/mL，4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?.2 mL HCl（0.04 mol/L），0.75 mL 去離子水，0.2 mL PEG400 和3.4 mL TMOS混勻，在4℃放置2～3 min預(yù)冷卻。然后將其放入冰水中，超聲混勻30 min，量取該溶液，按照體積比1∶2的比例將其加入預(yù)冷的抗體溶液中，期間緩慢攪拌，待凝膠形成后，稱取容器質(zhì)量，將凝膠置于37℃恒溫烘箱凝膠老化。待凝膠失去初重的50%時(shí)，老化過(guò)程結(jié)束。將老化后的凝膠（約1 g）研磨碎，能過(guò)30～40目篩即可，然后進(jìn)行裝柱。每個(gè)柱中裝填體積為1 mL；待柱中凝膠沉積穩(wěn)定后，用5 mL PBS預(yù)淋洗，洗去未包埋的抗體IgG和其他干擾雜質(zhì)，最后用5 mL PBS平衡。制備好的IAC柱中保留1 mL的PBS溶液，加上塞子和蓋子，在4℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?，長(zhǎng)期保存需加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%疊氮化鈉作為防腐劑。

1.5 IAC柱的評(píng)價(jià)

1.5.1 柱容量測(cè)試 取制備好的親和層析小柱，回復(fù)至室溫后，取下柱子上下端的塞子，將柱子與真空泵連接，調(diào)節(jié)流速，使柱子里面的液體以2 d/s的速度流出（流量不大于1 mL/min）。待液體排干后，將10 mL 10 μg/mL處理后的三聚氰胺溶液（溶解于上樣緩沖液中）上樣，流量同上。收集流出液，測(cè)定A240nm值。待液體排干后，分別用10 mL 0.01 mol/L pH 7.4 PBST，10 mL純水淋洗小柱，流速同上。分別收集淋洗液，并測(cè)定A240nm值。然后，加洗脫液2 mL到小柱中，調(diào)節(jié)流量1 d/s（不超過(guò)0.5 mL/min），收集洗脫液，測(cè)定A240nm值。分別用10 mL 0.01 mol/L pH 7.4 PBST，10 mL 0.01 mol/L pH 7.4 PBS清洗再生小柱，收集所有濾液，測(cè)定A240nm值。 漓干后，將柱子下端用塞子密封，然后加入3 mL 0.01 mol/L pH 7.4 PBS平衡保存液，上端用塞子密封，置于4℃保存。

1.5.2 三聚氰胺紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 采用紫外光譜儀，測(cè)定配制的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，在240 nm下的光密度值（OD），以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，不同標(biāo)準(zhǔn)品的A240nm值為縱坐標(biāo)，建立三聚氰胺微克級(jí)（μg/mL）標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用液相色譜質(zhì)譜，以三聚氰胺的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以三聚氰胺峰面積為縱坐標(biāo)，建立納克級(jí)（ng/mL）標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算柱容量測(cè)試中收集的濾液中三聚氰胺的質(zhì)量濃度。

1.5.3 三聚氰胺小柱回收率測(cè)試 分別上樣1、10、100、1 μg/mL質(zhì)量濃度的三聚氰胺溶液10 mL。按照上述方法操作小柱，收集洗脫液，分別采用紫外光譜儀和液相色譜質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定洗脫溶液，根據(jù)相應(yīng)的紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線和 計(jì)算洗脫液中三聚氰胺的含量，計(jì)算回收率（公式如下所示）。

其中V1為上樣體積 （mL）；C1為上樣質(zhì)量濃度（ng/mL）；V2為洗脫液體積 （mL）；C2為洗脫液質(zhì)量濃度（ng/mL）

1.5.4 三聚氰胺小柱富集系數(shù)測(cè)試 上樣10 ng/mL濃度水平的三聚氰胺溶液100 mL；用0.5 mL的洗脫液洗脫4次，分別進(jìn)行洗脫液接收，然后測(cè)定每管洗脫液的A240nm，根據(jù)紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算三聚氰胺的含量。計(jì)算當(dāng)回收率大于70%時(shí)，所需要的洗脫液總體積。

其中:V1:上樣體積（mL）；V2:洗脫液體積（mL）

1.5.5 三聚氰胺小柱再生次數(shù)測(cè)試 選取3支小柱，采用500 ng/mL質(zhì)量濃度的三聚氰胺溶液3 mL上樣測(cè)試，收集洗脫液，測(cè)定洗脫液的A240nm，根據(jù)紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算三聚氰胺的含量。測(cè)定小柱的平均回收率。每天測(cè)試一次，連續(xù)測(cè)試12 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1 微克級(jí)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定 用紫外掃描儀測(cè)得微克級(jí)標(biāo)準(zhǔn)溶液（1，2.5，5，10，25，50，100 μg/mL）的A240nm值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。y＝0.0145 x+0.023 2，線性度（R2）為 0.997 9，其中 x 為三聚氰胺的質(zhì)量濃度，y為溶液的A240nm值。

圖1 三聚氰胺微克級(jí)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of melamine

2.1.2 納克級(jí)標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定 利用液相質(zhì)譜測(cè)得 ng級(jí)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（10，25，50，100，250，500 ng/mL）的質(zhì)譜圖，方法參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22388，譜突如圖2所示.

圖2 納克級(jí)標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜一質(zhì)譜圖Fig.2 LC-MS spectrum for melamine detection

以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品的面積為縱坐標(biāo)，繪制出三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示:標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.115 4x+4.131 6，線性度（R2）為 0.984 2；其中 x 為質(zhì)量濃度，y 為質(zhì)譜峰相對(duì)峰面積。

圖3 三聚氰胺納克級(jí)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of melamine

2.2 免疫親和柱的柱容量

柱容量測(cè)試中，上樣溶液濾液收集體積10 mL，淋洗液收集體積10 mL，收集洗脫液2 mL，洗滌液和再生溶液體積20 mL，根據(jù)濾液的吸光度值，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算各個(gè)濾液中三聚氰胺的質(zhì)量濃度，將各含量用下面公式計(jì)算出柱容量:柱容量=洗脫液體積×洗脫液；計(jì)算得到柱容量為16.47 μg。

2.3 回收率

將1，10 ng/mL，100 ng/mL的上樣質(zhì)量濃度的三聚氰胺洗脫液進(jìn)行色譜－質(zhì)譜測(cè)試，根據(jù)峰面積采用ng級(jí)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.115 4x+4.131 6，測(cè)定得出三聚氰胺質(zhì)量濃度，根據(jù)回收率公式計(jì)算出回收率。將1 μg/mL質(zhì)量水平的洗脫液，測(cè)定出A240nm值，根據(jù)三聚氰胺紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算三聚氰胺濃度，根據(jù)回收率公式計(jì)算出回收率如表1所示。

表1 不同質(zhì)量濃度三聚氰胺樣品的回收率Table 1 Recovery of melamine in different concentrations

2.4 富集系數(shù)

分別測(cè)定了4份洗脫液在240 nm下的紫外吸收值，結(jié)果如下表2所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.014 5x+0.023 2計(jì)算出三聚氰胺的質(zhì)量濃度水平，并計(jì)算出回收率。從表2可知，當(dāng)使用1.5 mL洗脫液時(shí)，回收率即可達(dá)到70.34%，當(dāng)使用2.0 mL洗脫液時(shí)，回收率達(dá)到80%以上，根據(jù)富集系數(shù)計(jì)算公式，得出富集系數(shù)為66。在免疫親和柱的使用過(guò)程中，研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)控制濾液流速，可以保證包埋抗體對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的捕獲，流量控制在1 mL/min以下較好。

2.5 再生次數(shù)

表2 洗脫液中三聚氰胺質(zhì)量濃度測(cè)定和回收率結(jié)果Table 2 Results of melamine level and recovery in eluent solutions

測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。在本試驗(yàn)中，小柱的測(cè)試是每天使用一次，當(dāng)小柱累計(jì)使用次數(shù)為5時(shí)，IAC小柱的回收率為63%，當(dāng)累計(jì)使用次數(shù)為4時(shí)，回收率均高于70%。使用次數(shù)為8時(shí)，回收率均高于40%，之后再重復(fù)使用，小柱的回收率則大幅下降，10次使用后則下降至12%左右。由于抗體屬于生物大分子，容易受到離子濃度、溶液pH及有機(jī)溶劑的破壞，通過(guò)再生緩沖液的使用，延長(zhǎng)了小柱的使用壽命。

表3 IAC小柱重復(fù)使用次數(shù)測(cè)定Table 3 Detection for possible reusage of IAC columns

3 結(jié)語(yǔ)

采用硅烷化包埋的方法制備了三聚氰胺的免疫親和層析柱，并對(duì)三聚氰胺免疫親和小柱的使用性能進(jìn)行了測(cè)定，小柱的柱容量為16.47 μg/柱，富集系數(shù)為66，小柱連續(xù)使用12次后，發(fā)現(xiàn)，使用5次后小柱的平均回收率仍然在60%以上，使用4次后平均回收率在70%以上。試驗(yàn)中采用淋洗液減少了潛在的非特異性吸附效應(yīng)。免疫親和小柱在樣本處理時(shí)具有高度特異性，且可重復(fù)使用以及其在使用過(guò)程中不涉及到大量有毒有害溶劑的使用，有望成為樣本前處理手段的發(fā)展方向。

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