李流川， 婁永江， 楊文鴿

（寧波大學(xué) 海洋學(xué)院/應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211）

魚(yú)糜是一種新型的水產(chǎn)調(diào)理食品原料。它調(diào)理簡(jiǎn)便，細(xì)嫩味美，又耐儲(chǔ)藏，頗適合大眾消費(fèi)。魚(yú)糜漂洗加工過(guò)程中流失的蛋白質(zhì)約占全部魚(yú)肉蛋白質(zhì)的30%～40%[1-3]。將漂洗水中流失的蛋白質(zhì)進(jìn)行回收和重新利用，不僅能增加企業(yè)的效益，而且可以顯著降低廢水中化學(xué)耗氧量（COD），大大減少?gòu)U水處理的成本[3-6]。

目前國(guó)內(nèi)外回收蛋白質(zhì)的方法有pH調(diào)節(jié)法、加熱法、膜分離法、離子交換法和凝聚法等[7]。但普遍存在回收停留在實(shí)驗(yàn)室理論階段，未實(shí)現(xiàn)工廠化投產(chǎn)；蛋白回收率不高，最高為80%；操作復(fù)雜，工序較多；前期資金投入大，成本較高等問(wèn)題[8-10]。作者旨在找出一種經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，安全可靠，回收率高，原料來(lái)源廣泛，價(jià)格便宜的絮凝劑。如果絮凝劑的種類和投加量選擇合適，回收的蛋白質(zhì)可用作動(dòng)物飼料優(yōu)質(zhì)蛋白直接利用，同時(shí)降低廢水的COD，降低廢水處理成本，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、社會(huì)三贏。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

魚(yú)糜加工廢水:寧波象山某魚(yú)糜加工企業(yè)提供；硫酸鐵銨、硫酸鋁、硫酸鐵、氯化鋁、氯化鐵、明礬、陽(yáng)離子聚丙烯酰胺、聚合硫酸鐵、聚合硅酸鐵:均為分析純?cè)噭豢捡R斯亮藍(lán)G-250、牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白、殼聚糖、海藻酸鈉:均為生化試劑。

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋:常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司產(chǎn)品；RO DI digital plus實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī):上海和泰儀器有限公司產(chǎn)品；SH220石墨消解儀:濟(jì)南海能儀器有限公司產(chǎn)品；UV2102-C紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):尤尼柯（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；HSF-3F pH計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

蛋白質(zhì)測(cè)定:考馬斯亮藍(lán)法[11-12]，牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線法[13]。

回收率:通過(guò)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)出廢水蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，然后按下式計(jì)算。

式中:W為蛋白回收率，%；M為魚(yú)糜廢水原液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/L；M1為絮凝后上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/L；M2為絮凝后蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/L。

1.2.1 單因素絮凝法 等電點(diǎn)沉淀法[14]:用HCL、NaOH溶液調(diào)節(jié)魚(yú)糜廢水的pH值，使pH控制在（3、3.5、4～7、7.5、8）。

絮凝劑及其質(zhì)量濃度對(duì)回收效果影響:將殼聚糖、海藻酸鈉、陽(yáng)離子聚丙烯酰胺、聚合硫酸鐵、微生物絮凝劑、硫酸鐵銨、硫酸鋁、硫酸鐵、氯化鋁、氯化鐵、明礬，分別按質(zhì)量濃度（0、0.05、0.1～0.3、0.35、0.4 g/L）加入到魚(yú)糜廢水中。

絮凝時(shí)間、溫度回收效果影響:在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)選定的絮凝劑控制作用溫度（5、10、15、20、25、30 ℃），沉降時(shí)間（0、1、～7，8 h）進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design-expert軟件的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)[15-16]，以回收率作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，進(jìn)行絮凝劑添加量、絮凝時(shí)間、絮凝溫度、絮凝pH的四因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 等電點(diǎn)絮凝法

在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零（即正負(fù)電荷相等），此時(shí)蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒(méi)有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，其溶解度最小，最易形成沉淀物[10]。用HCl、NaOH溶液調(diào)節(jié)魚(yú)糜廢水溶液pH分別為:3、3.5～7.5、8，通過(guò)牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線法，測(cè)得蛋白質(zhì)回收率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 pH對(duì)魚(yú)糜廢水中蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.1 Effects on surimi wastewater protein recycling of pH

從圖1可見(jiàn)，魚(yú)糜廢水中蛋白質(zhì)的回收率隨pH的增加先增大，后減小最后趨于平緩。當(dāng)pH=5.5時(shí)陡然達(dá)到最大，此時(shí)回收率為65.8%。據(jù)此，確定魚(yú)糜廢水中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為5.5。

2.2 絮凝劑的選擇

以陽(yáng)離子聚丙烯酰胺、聚合硫酸鐵、聚合硅酸鐵、海藻酸鈉、殼聚糖、硫酸鐵銨、硫酸鋁、硫酸鐵、氯化鋁、氯化鐵、明礬共11種絮凝劑，對(duì)魚(yú)糜廢水蛋白進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 絮凝劑種類對(duì)魚(yú)糜廢水蛋白回收的效果圖影響Fig.2 Effect on surimi wastewater protein recycling of flocculant species

從圖2可見(jiàn)，上述絮凝劑都具有隨添加量的逐漸增大，蛋白回收率先急速增大最后逐漸趨于平緩的特點(diǎn)。當(dāng)氯化鐵添加量為0.15 g/L時(shí)，魚(yú)糜廢水蛋白回收率最大為72.25%。鑒于三氯化鐵價(jià)格較為便宜，來(lái)源方便，安全可靠，綜合分析，確定選用三氯化鐵作為魚(yú)糜廢水蛋白回收的絮凝劑。

2.3 絮凝時(shí)間、溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響

2.3.1 作用時(shí)間對(duì)絮凝效果的影響 以三氯化鐵作為絮凝劑，選用上圖3中回收率最大添加量即為:0.15 g/L，室溫（20 ℃）。 控制絮凝時(shí)間為（0、1～7、8 h）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 絮凝時(shí)間對(duì)魚(yú)糜廢水中蛋白質(zhì)回收率影響Fig.3 Effect on surimi wastewater protein recycling of flocculant time

從圖3可見(jiàn)，隨絮凝時(shí)間的延長(zhǎng)，回收率先快速增大后趨于平緩。當(dāng)絮凝4 h時(shí)，回收率最大達(dá)到73.74%。則:絮凝時(shí)間為4 h。

2.3.2 絮凝溫度對(duì)絮凝效果的影響 控制三氯化鐵的濃度為 0.15 g/L，絮凝時(shí)間為 4 h，以 5、10、15、20、25、30℃的溫度條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

從圖4可見(jiàn)，隨絮凝溫度的增大，回收率先緩慢增大再平穩(wěn)下降。當(dāng)絮凝溫度為15℃時(shí)，回收率達(dá)最大為74.13%。

圖4 絮凝溫度對(duì)魚(yú)糜廢水回收的影響Fig.4 Effect on surimi wastewater protein recycling of flocculant temperature

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析 在以上絮凝劑添加量、絮凝時(shí)間、絮凝溫度、絮凝pH單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇合理的因素水平見(jiàn)表1，采用Design-expert軟件的Box-Behnken中心組設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)四因素三水平實(shí)驗(yàn)，以回收率作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and Levels of response surface experimental

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results

續(xù)表2

利用Design-Expert軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸，得到魚(yú)糜加工廢水蛋白回收率對(duì)以上4因素的二次多項(xiàng)回歸模型為:蛋白質(zhì)回收率=522.65A+6.377B+4.829 17C+91.71D-2.4AB-23.1AC+5.5AD-0.265BC-0.384BD+0.895CD-1 570.5A2-0.064 9B2-0.056 25C2-8.34D2-274.335 83

對(duì)模型進(jìn)行回歸方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3；對(duì)回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4[16]。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，此模型的F值29.77，P＜0.000 1，回歸模型高度顯著。表4結(jié)果表明:模型的一次項(xiàng)A、D 極顯著，B、C 不顯著；二次項(xiàng) A2、B2、D2極顯著，C2不顯著；交互項(xiàng) AC、BC、BD 顯著。

失擬項(xiàng)P=0.000 3，顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.967 5，說(shuō)明模型擬合程度良好，該模型可以較好的分析和預(yù)測(cè)絮凝劑對(duì)魚(yú)糜廢水蛋白質(zhì)回收效果。

表4 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table4 Significancetestoftheregressionmodelcoefficients

2.4.2 因素間交互作用 為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用，通過(guò)Design-expert繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖來(lái)進(jìn)行直觀分析，結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。等高線圖可以直觀的反映兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反。

圖5 絮凝劑質(zhì)量濃度和溫度對(duì)回收率的影響Fig.5 Effects on recoverying of Flocculant concentration and temperature

圖6 絮凝溫度和pH值對(duì)回收率的影響Fig.6 Effects of the the flocculation temperature and pH on recovery

從圖5和圖6可以明顯看出絮凝劑添加量和絮凝溫度，絮凝溫度和絮凝pH值之間存在明顯的交互作用，表現(xiàn)為等高線呈橢圓形。緣于其他各因素的交互作用不明顯，這里不再討論。

由該軟件分析得出最優(yōu)配方及評(píng)定結(jié)果為:三氯化鐵添加量為0.13 g/L、絮凝溫度為18.44℃、時(shí)間5 h、pH為5.44，此時(shí)回收率最大為87.04%。

按照響應(yīng)面最佳條件，對(duì)魚(yú)糜廢水蛋白質(zhì)進(jìn)行3次平行回收驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的平均值為86.94%，而預(yù)測(cè)最大值為87.04%，兩者吻合得較好。

3 結(jié)語(yǔ)

1）最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件絮凝法，較之單一的等電點(diǎn)回收和自然條件絮凝劑沉降回收，魚(yú)糜廢水蛋白回收率具有很大的提高。

2）通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得出:采用三氯化鐵添加量0.13 g/L、絮凝溫度 18.44℃、時(shí)間 5 h、pH 5.44對(duì)魚(yú)糜廢水中蛋白質(zhì)進(jìn)行回收，回收率可達(dá)86.94%，較之目前最大的回收率80%有了很大的提高。三氯化鐵來(lái)源廣泛，價(jià)格便宜，回收操作簡(jiǎn)單，是一種高效實(shí)用的蛋白質(zhì)回收方法。

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