沈瑤瑤 ， 劉春鳳 ， 李 崎 *

（1.江南大學(xué) 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

我國是世界啤酒生產(chǎn)和消費(fèi)大國，被消費(fèi)的啤酒中大部分是熟啤酒，純生啤酒僅占5%。熟啤酒是經(jīng)過巴氏滅菌或瞬時高溫滅菌的啤酒；純生啤酒是不經(jīng)巴氏滅菌或瞬時高溫滅菌，而采用物理過濾方法除菌，達(dá)到一定生物穩(wěn)定性的啤酒[1]。正是由于純生啤酒沒有經(jīng)過巴氏滅菌，口感新鮮，受到了很多消費(fèi)者的青睞。相關(guān)研究中指出[2]，純生啤酒的膜過濾階段會攔截少量蛋白質(zhì)及多酚物質(zhì)，同時熟啤酒的巴氏滅菌過程也會加速啤酒的老化，然而對于純生啤酒與熟啤酒在老化與抗老化方面的對比還沒有詳細(xì)報道。

TBA（硫代巴比妥酸）法是評價啤酒老化程度的較為常見的方法之一[3]。其原理是通過啤酒中羰基化合物與TBA特異性生色反應(yīng)來表示啤酒的老化程度[4-5]。啤酒的四大老化前驅(qū)物質(zhì)氨基酸、高級醇、不飽和脂肪酸和異α酸，在啤酒老化過程中會產(chǎn)生老化物質(zhì)，主要是羰基類化合物。氨基酸會發(fā)生Strecker降解生成醛類如2-甲基丙醛和苯乙醛[6]，高級醇可被氧化為相應(yīng)的醛類，如乙醇在1-羥乙基自由基存在是可生成乙醛[7]，不飽和脂肪酸被認(rèn)為與啤酒中重要的老化物質(zhì)反-2-壬烯醛的生成有關(guān)[8]，異α酸可以在老化過程中會降解為羰基化合物[9]。

DPPH清除率是評價啤酒抗老化程度的較為常見的方法之一。自由基的存在可以影響啤酒老化物質(zhì)的形成[10]，啤酒具有一定的內(nèi)源性抗老化能力，可以清除自由基。DPPH（二苯代苦味酰肼自由基）是一種穩(wěn)定的自由基，通過測定啤酒對其清除率，可以表示啤酒的抗老化能力[11]。啤酒中的多酚物質(zhì)具有還原性，是啤酒的天然抗氧化劑[12]。其中花色苷是易與蛋白質(zhì)產(chǎn)生冷混濁的物質(zhì)，具有一定的抗老化能力。

研究膜過濾以及巴氏滅菌過程對啤酒的影響，考察純生啤酒與熟啤酒在貯存過程中的老化情況，對啤酒市場具有一定的引導(dǎo)性。作者在系統(tǒng)研究膜過濾以及巴氏滅菌對老化指標(biāo)、老化前驅(qū)物質(zhì)、老化物質(zhì)以及抗老化指標(biāo)、抗老化物質(zhì)的影響，比較了純生啤酒與熟啤酒在老化及抗老化水平方面的差異。這對于純生啤酒與熟啤酒生產(chǎn)過程中的工藝控制和品質(zhì)提升具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑:二苯代苦味酰肼自由基 （DPPH，純度90%）:購自東京工業(yè)株式會社；異α酸（64.3%）二環(huán)己基胺鹽（DCHA）標(biāo)樣:購自ASBC（美國釀造化學(xué)家協(xié)會）；乙腈、甲醇:色譜純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫代巴比妥酸、乙酸、乙醇等:分析純，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；尼龍66粉:作者所在實驗室自制。

材料:0.45 μm微孔濾膜為混合纖維素膜，購自上海新亞凈化器件廠。

酒樣:樣品1、2、3:不同酒廠的清酒；實際生產(chǎn)酒樣:純生啤酒生產(chǎn)線。

1.2 儀器

UV2100型分光光度計:尤尼柯UNIC0（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；Waters 600高效液相色譜儀:Waters1525泵，Breeze色譜工作站，美國Waters公司產(chǎn)品；SHZ-22恒溫水浴器:江蘇省太倉市醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 啤酒樣品處理方法

1）實驗室模擬處理方法 純生啤酒:用0.45 μm微孔濾膜為過濾介質(zhì)抽濾清酒，備用；熟啤酒:將清酒灌裝壓蓋，62℃水浴30 min后，取出用自來水冷卻，備用。 圖 2（a）與圖 3（a）中 3個樣品為 3個酒廠3條生產(chǎn)線的清酒，分別在實驗室模擬條件下做出純生啤酒與熟啤酒，測定了啤酒的老化指標(biāo)、老化前驅(qū)物質(zhì)、抗老化指標(biāo)以及抗老化物質(zhì)等指標(biāo)。

2） 實際生產(chǎn)取樣方法 圖2（b）與圖3（b）中酒樣取自純生啤酒生產(chǎn)線 （與樣品二取自同一酒廠）清酒、0.65 μm 膜濾后、0.45 μm 膜濾后酒樣，并將清酒灌裝壓蓋在酒廠巴氏滅菌機(jī)中進(jìn)行巴氏滅菌。此部分為驗證實驗室模擬條件下得出的結(jié)論，故只測定老化指標(biāo)、老化物質(zhì)與抗老化指標(biāo)等啤酒表觀指標(biāo)。

1.3.2 TBA測定 TBA溶液配制:稱取0.165 g硫代巴比妥酸，加入體積分?jǐn)?shù)50%乙酸溶液邊攪拌邊溶解，使其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.33%。測定:啤酒除氣后，取5 mL啤酒樣品與2 mL TBA溶液，搖勻于60℃水浴1 h，自來水沖洗冷卻。空白為5 mL啤酒樣品與2 mL蒸餾水，于530 nm下比色，以A值表示TBA值。

1.3.3 醛類測定[13]SPME-GC-MS法。

1.3.4 氨基酸[14]、異α酸測定[15]RP-HPLC法。

1.3.5 高級醇測定[14]HS-GC法。

1.3.6 不飽和脂肪酸測定[14]液液萃取后，GC法。

1.3.7 DPPH清除率測定 DPPH溶液配置:準(zhǔn)確稱量20 mg DPPH，用無水乙醇定容至250 mL，測定:取5 mL除氣啤酒于100 mL容量瓶中，超純水定容，即酒樣稀釋20倍。

其中:Ai:2 mL待測液+2 mL DPPH的吸光值；Aj:2 mL待測液+2 mL無水乙醇的吸光值；Ac:2 mL無水乙醇+2 mL DPPH的吸光值?；靹蚝螅诎凳抑蟹胖? h，在 517 nm 下測定吸光值，測 Ai、Aj、Ac時均用乙醇作為空白。

1.3.8 總多酚、花色苷測定 比色法。

2 結(jié)果與討論

2.1 純生啤酒與熟啤酒的老化與抗老化水平跟蹤

取同品牌原料相近、生產(chǎn)工藝相近的市售純生啤酒與熟啤酒，從其生產(chǎn)之日開始貯存，一段時間后取樣測其TBA值與DPPH清除率，結(jié)果見圖1。

圖1 市售純生啤酒與熟啤酒貯存期內(nèi)TBA值（a）和DPPH清除率（b）變化Fig.1 Variation trend of draft beer and pasteurized beer’s TBA（a） and DPPH clearance rate（b）

由圖1可以看出，原料相近、生產(chǎn)工藝相近的純生啤酒與熟啤酒相比，起初純生啤酒的TBA值較低，老化程度低于熟啤酒?？梢?，與純生啤酒的膜過濾過程相比，熟啤酒的巴氏滅菌過程加速了啤酒的老化，使老化物質(zhì)尤其是與TBA特異性結(jié)合的羰基化合物的含量增多。同時，指示啤酒抗老化能力的指標(biāo)DPPH清除率純生啤酒起初也低于熟啤酒，這可能與其膜過濾的過程有關(guān)。隨貯存時間的延長，在10～20 d內(nèi)，純生啤酒的老化程度會逐漸超過熟啤酒。熟啤酒中起初的抗老化物質(zhì)較多，起到了更明顯的抗老化作用，使其在貯存過程中較純生啤酒更有優(yōu)勢，更加穩(wěn)定，老化速率緩慢。

2.2 純生啤酒與熟啤酒后處理過程對老化水平的影響

2.2.1 老化指標(biāo)與老化物質(zhì)的檢測

1）TBA值的測定 試驗分別對3種清酒進(jìn)行膜過濾及巴氏滅菌處理后測定其TBA值，結(jié)果見圖2。

圖2 不同除菌方式對模擬生產(chǎn)（a）和實際生產(chǎn)（b）的啤酒TBA值的影響Fig.2 Influence of different aseptic way on beer’s TBA in imitation （a） or in real production （b）

由圖2（a）可知，清酒經(jīng)模擬純生啤酒膜過濾處理之后，與未過濾清酒樣品相比，其TBA值都有所下降，3種酒樣分別下降了10.12%、7.69%、5.44%。微濾膜過濾過程對可與硫代巴比妥酸發(fā)生生色反應(yīng)的物質(zhì)有一定的截留或吸附作用，從而降低了啤酒的TBA值。而經(jīng)過巴氏滅菌以后，啤酒樣品的TBA值較清酒分別增加了4.76%、8.10%、2.17%，巴氏滅菌過程加速了啤酒老化反應(yīng)的進(jìn)程，產(chǎn)生了較多的羰基化合物，雖然微濾和加熱兩個過程對不同酒樣的影響程度不同，但是3種清酒的變化趨勢相同。故模擬的相同品牌的純生啤酒與熟啤酒相比，膜處理較巴氏滅菌工藝酒樣的老化程度低，老化物質(zhì)含量少。

由于0.45 μm膜濾時采用抽濾的方法，純生啤酒TBA值的降低有可能是羰基化合物揮發(fā)導(dǎo)致，為驗證微濾過程膜對老化物質(zhì)有一定截留或吸附作用，取純生啤酒生產(chǎn)線的清酒、0.65 μm膜濾后酒樣、0.45 μm膜濾后酒樣，并將裝瓶的清酒進(jìn)行隧道式巴氏滅菌，測定TBA值，結(jié)果如圖2（b）。

從圖2（b）可知，實際生產(chǎn)中的膜過濾與巴氏滅菌對啤酒老化水平的影響與實驗室模擬的效果相同，膜過濾后的TBA值也呈遞減趨勢，因?qū)嶋H生產(chǎn)膜過濾裝置是密閉的，故可以證明與硫代巴比妥酸發(fā)生生色反應(yīng)的物質(zhì)被濾膜截留或吸附，導(dǎo)致最終吸光度的下降，而熟啤酒的TBA值上升了1.67%，最終純生啤酒的老化水平低于熟啤酒。

2）老化物質(zhì)-醛類的檢測 試驗對清酒分別進(jìn)行0.45 μm膜過濾及巴氏滅菌后測定其醛類質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果如表1所示。老化醛類與硫代巴比妥酸特異性結(jié)合，是TBA法的測定基礎(chǔ)，從表1中可以看出，膜過濾后啤酒中的醛類物質(zhì)總量減少了4.11%，而巴氏滅菌過程醛類總質(zhì)量分?jǐn)?shù)從45.03 mg/L升高到58.92 mg/L，升高了30.85%，這也是TBA值會升高的原因（圖2）。故過濾處理會造成啤酒中老化物質(zhì)減少，而加熱使老化物質(zhì)明顯增多，熟啤酒老化程度高于純生啤酒與清酒。

表1 不同除菌方式對老化醛類質(zhì)量濃度的影響Table 1 Influence of different aseptic way on aldehydes（mg/L）

2.2.2 純生啤酒與熟啤酒后處理過程老化前驅(qū)物質(zhì)的檢測

1）氨基酸質(zhì)量濃度的測定 氨基酸是啤酒的四大老化前驅(qū)物質(zhì)之一。啤酒中氨基酸可能是老化物質(zhì)醛類化合物的來源之一，氨基酸和α-羧酸化合物之間發(fā)生反應(yīng)，即Strecker反應(yīng)，生成相應(yīng)的strecker醛。如3-甲硫基丙醛和苯乙醛分別來源于L-蛋氨酸和L-苯丙氨酸，溫度高會加速該類反應(yīng)[6]。對清酒分別進(jìn)行0.45 μm膜過濾及巴氏滅菌后測定其氨基酸含量，結(jié)果見表2。

從表2中看出，膜過濾后啤酒樣品中氨基酸總量分別下降了4.51%、22.59%、7.92%，部分單種氨基酸質(zhì)量濃度較低，增加或者下降不明顯，然而質(zhì)量濃度較多的單體氨基酸其經(jīng)過膜過濾之后下降趨勢較明顯，如2-甲基丙醛的前體纈氨酸質(zhì)量濃度分別下降4.73%、4.47%、11.43%，脯氨酸的質(zhì)量濃度分別下降5.66%、26.04%、7.18%。純生啤酒中氨基酸質(zhì)量濃度的減少是膜的攔截作用的結(jié)果，而熟啤酒中氨基酸質(zhì)量濃度的減少可能是發(fā)生了strecker降解。從氨基酸這一老化前驅(qū)物質(zhì)出發(fā)，熟啤酒比純生啤酒老化前驅(qū)物質(zhì)質(zhì)量濃度高，TBA值較高也證明了熟啤酒經(jīng)滅菌后老化物質(zhì)較多。

表2 氨基酸質(zhì)量濃度的測定Table 2 Content of amino acids （mg/L）

2）異α酸的測定 試驗對清酒樣品分別進(jìn)行0.45 μm膜過濾及巴氏滅菌后測定其異α酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)及苦味值，結(jié)果見表3。

表3 異α酸質(zhì)量濃度的測定Table 3 Content of iso-a acids（mg/L）

從表3可以看出，3種樣品經(jīng)過膜過濾后啤酒中異α酸質(zhì)量濃度都有所下降，而巴氏滅菌后的熟啤酒中異α酸質(zhì)量濃度有升有降，分別降低4.33%、升高0.36%、降低2.87%。與清酒樣品相比，膜過濾過程分別有7.15%、6.36%、10.09%異α酸被攔截，使啤酒中老化前驅(qū)物質(zhì)質(zhì)量濃度減少。而熟啤酒中異α酸質(zhì)量濃度的略微降低與加熱過程的異α酸熱降解有關(guān)，而其降解產(chǎn)物是不同長度的羰基化合物，即可能生成了老化物質(zhì)，使熟啤酒的老化程度加深。

3）高級醇的測定 高級醇是啤酒老化前驅(qū)物質(zhì)之一，在啤酒老化過程中會發(fā)生氧化反應(yīng)及醇醛縮合反應(yīng)，生成相應(yīng)的醛類。試驗分別對3種清酒進(jìn)行膜過濾及巴氏滅菌處理后測定3種高級醇質(zhì)量濃度，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，清酒經(jīng)過膜過濾之后樣品2的高級醇質(zhì)量濃度了增加了0.79%，樣品1和樣品3分別減少了4.41%、2.94%，有增有減說明這3種重要高級醇質(zhì)量濃度受膜過濾影響不大，可能與其相對分子質(zhì)量小，空間結(jié)構(gòu)小有關(guān)。而清酒經(jīng)過巴氏滅菌之后，高級醇質(zhì)量濃度也是有增有減，變化沒有規(guī)律，說明巴氏滅菌過程對這3種高級醇的影響不大，且沒有規(guī)律可循。

表4 3種高級醇質(zhì)量濃度測定Table 4 Content of higher alcohols（mg/L）

4）不飽和脂肪酸的測定 試驗分別對3種清酒進(jìn)行膜過濾及巴氏滅菌處理后測定脂肪酸，表5中列出了4種不飽和脂肪酸的質(zhì)量濃度。在老化過程中不飽和脂肪酸會發(fā)生自身氧化，生成羰基化合物。由表5可見，經(jīng)過膜過濾的純生啤酒中不飽和脂肪酸的質(zhì)量濃度分別減少了33.68%、12.5%、20.63%，可見微濾過程對長鏈的不飽和脂肪酸有一定的截留或者吸附作用。而巴氏滅菌后熟啤酒中的不飽和脂肪酸質(zhì)量濃度增減沒有規(guī)律，研究表明[9]不飽和脂肪酸含量在老化一段時間后才有所減少，故在巴氏滅菌之后，變化不明顯。

表5 不飽和脂肪酸質(zhì)量濃度測定Table 5 Content of unsaturatedfatty acid（mg/L）

2.3 純生啤酒與熟啤酒后處理過程對抗老化水平的影響

2.3.1 DPPH清除率的測定 試驗對清酒分別進(jìn)行0.45 μm膜過濾及巴氏滅菌后測定其DPPH清除率，結(jié)果見圖3。

由圖3（A）可見，清酒經(jīng)過膜過濾以后，3種酒樣的DPPH清除率分別下降了3.974%、1.291%、4.340%，即其抗老化能力下降。而經(jīng)過巴氏滅菌后的DPPH清除率也略有下降，但下降幅度很小。模擬的純生啤酒的抗老化能力不如清酒與熟啤酒，其DPPH清除率下降的主要原因可能是啤酒膜過濾過程截留或吸附了內(nèi)源性抗老化物質(zhì)。加熱過程中啤酒中產(chǎn)生大量自由基，加熱的過程會加速啤酒中物質(zhì)的自由運(yùn)動，增加碰撞并結(jié)合的幾率，使啤酒中更多的抗老化物質(zhì)與自由基結(jié)合，故測定DPPH清除率時，可與DPPH自由基結(jié)合的抗老化物質(zhì)減少，使的DPPH清除率略微下降。

圖3 不同除菌方式對模擬（a）和實際生產(chǎn)（b）的啤酒DPPH清除率的影響Fig.3 Influence of different aseptic way on beer’s DPPH clearance rate in imitation （a） or in real production（b）

取純生啤酒生產(chǎn)線的清酒、0.65 μm膜過濾之后的啤酒、0.45 μm膜過濾之后的啤酒，并將清酒裝瓶進(jìn)入隧道式巴氏滅菌機(jī)進(jìn)行巴氏滅菌，并測4種酒樣的DPPH清除率，結(jié)果見圖3（b）。深層膜過濾與實驗室的單層膜過濾有相同效果，可機(jī)械截留或者深層吸附抗老化物質(zhì)，經(jīng)過兩道膜過濾之后，啤酒的DPPH清除率下降了3.24%，而隧道巴氏滅菌與實驗室模擬的滅菌結(jié)果相似，使DPPH清除率下降了1.32%，小于膜過濾對其的影響。故模擬與生產(chǎn)中，純生啤酒比熟啤酒的抗老化能力都要弱。

2.3.2 總多酚及花色苷的測定 試驗對清酒分別進(jìn)行0.45 μm膜過濾及巴氏滅菌后測定其總多酚質(zhì)量濃度見圖4，酒樣1的花色苷質(zhì)量濃度見表6。

表6 不同除菌方式對花色苷質(zhì)量濃度的影響Table 6 Influence of different aseptic way on anthocyanin

圖4 不同除菌方式對多酚質(zhì)量濃度的影響Fig.4 Influenceofdifferentasepticway on Total polyphenols and anthocyanin

由圖4可以看出，總多酚在經(jīng)過膜濾后質(zhì)量濃度分別降低了9.149%、4.439%、6.022%，酒樣1中花色苷質(zhì)量濃度降低了19.74%。多酚中兒茶酸類、花色素原和活性蛋白質(zhì)低溫下易聚合形成大顆粒物質(zhì)，造成啤酒“冷混濁”，在純生啤酒冷過濾時易被濾掉，這也是純生啤酒DPPH清除率下降（圖3）的原因之一。膜過濾使純生啤酒中花色苷下降了19.74%，這也成為純生啤酒DPPH清除率下降的潛在原因之一。而熟啤酒中總多酚、花色苷的質(zhì)量濃度與清酒相當(dāng)，可見巴氏滅菌的過程對總多酚、花色苷的影響較小，這也是巴氏滅菌對DPPH清除率影響較小的原因。

3 結(jié)語

從表征啤酒老化程度的指標(biāo)TBA值看，膜過濾過程對可與TBA發(fā)生特異性生色反應(yīng)的物質(zhì)有過濾或者吸附，使純生啤酒的TBA值低于清酒，老化程度降低。而清酒經(jīng)過巴氏滅菌后，TBA值升高，醛類含量升高，熟啤酒的老化程度加深。

從啤酒四大老化前驅(qū)物質(zhì)上看，膜過濾對氨基酸、異α酸和不飽和脂肪酸有一定的截留作用，從而使純生啤酒中老化前驅(qū)物質(zhì)含量較清酒少。而巴氏滅菌過程對這4種老化前驅(qū)物質(zhì)質(zhì)量濃度的影響不明顯。從相同清酒得到的純生啤酒與熟啤酒相比，純生啤酒中老化前驅(qū)物質(zhì)較熟啤酒中少。故貯存初期，純生啤酒的老化程度低于熟啤酒，且老化前驅(qū)物質(zhì)也少于熟啤酒，在口感及新鮮度上優(yōu)于熟啤酒。

熟啤酒經(jīng)過巴氏滅菌后，對抗老化指標(biāo)DPPH清除率有較大貢獻(xiàn)的多酚物質(zhì)在加熱過程中含量減少幅度較小，故抗老化能力只是略有下降。而不論是平板膜過濾的模擬酒樣還是深層膜過濾的真正純生啤酒，其抗老化能力都不及清酒以及熟啤酒。這是純生啤酒在貯存期內(nèi)老化速率快于熟啤酒甚至慢慢趕超熟啤酒老化程度的原因之一。

綜上，加熱是啤酒老化加速的重要原因之一，巴氏滅菌過程加速了啤酒的老化，老化物質(zhì)明顯增多，同時也微量損耗了啤酒中的抗老化物質(zhì)。而膜過濾攔截或吸附了部分抗老化物質(zhì)以及羰基化合物，降低了純生啤酒的抗老化能力，同時使老化程度也略有降低。貯存過程中熟啤酒比純生啤酒穩(wěn)定稍好:熟啤酒在初期的老化程度高于純生啤酒，但是由于抗老化物質(zhì)含量較多，在長期貯存時，比純生啤酒更有優(yōu)勢，老化速率低于純生啤酒。

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