龔燕燕， 殷 欣， 鄔敏辰， 曾 妍

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3.江南大學(xué) 無(wú)錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

阿魏酸（Ferulic acid），化學(xué)名為 4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸，是普遍存在于多種植物中的一種酚酸[1]，除少數(shù)以游離形式存在外，在細(xì)胞壁中阿魏酸或二聚體阿魏酸主要以酯鍵的形式連接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖殘基上[2-3]，可增強(qiáng)阿拉伯木聚糖鏈的強(qiáng)度，但從空間上限制了動(dòng)物和微生物對(duì)植物細(xì)胞壁中纖維素、半纖維素的有效降解。

阿魏酸酯酶（E.C.3.1.1.73，F(xiàn)erulic acid esterase，F(xiàn)AE）又稱肉桂酸酯酶，是羧酸水解酶的一個(gè)亞類，屬于胞外酶，能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，將阿魏酸釋放出來(lái)[4-5]。自1991年Faulds[6]等首次分離出阿魏酸酯酶以來(lái)，已有超過(guò)30種阿魏酸酯酶被純化，其主要生物功能是水解植物細(xì)胞壁中多糖與阿魏酸連結(jié)的酯鍵，釋放出游離的單體阿魏酸或阿魏酸二聚體[7]。阿魏酸因其具有較強(qiáng)的抗氧化活性和防腐作用而被廣泛應(yīng)用，它也是目前諸多藥材中的有效成分，并在新型藥材開(kāi)發(fā)和化妝品行業(yè)廣受青睞[8]。反式阿魏酸在美國(guó)、日本已被允許用作食品添加劑[1]，合成品阿魏酸鈉具有治療偏頭痛、抑制花生四烯酸代謝等作用[9]。目前生產(chǎn)阿魏酸的方法有化學(xué)合成法、堿法和酶法，化學(xué)合成法因?yàn)榉磻?yīng)周期長(zhǎng)和產(chǎn)率低限制了其發(fā)展；堿解法是目前商品化生產(chǎn)阿魏酸的主要途徑，但該法受原料限制，產(chǎn)量低，成本高，因而國(guó)際市場(chǎng)上阿魏酸的價(jià)格居高不下[10]。近年來(lái)通過(guò)酶解法生產(chǎn)阿魏酸已逐漸吸引眾多學(xué)者的關(guān)注。已有報(bào)道表明，阿魏酸酯酶可以和其它的半纖維素酶（如木聚糖酶）協(xié)同作用促使微生物對(duì)植物細(xì)胞壁進(jìn)行最大程度的降解[11]。因此，阿魏酸酯酶在造紙業(yè)、飼料業(yè)、乙醇制造等諸多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

作者利用實(shí)驗(yàn)室保藏的宇佐美曲霉菌株Aspergillus usamii E001，結(jié)合生物信息學(xué)分析的手段，借助RT-PCR技術(shù)克隆了編碼阿魏酸酯酶A的cDNA片段，并實(shí)現(xiàn)了其在畢赤酵母GS115中的分泌表達(dá)。同時(shí)，對(duì)reAusFaeA的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)表明該酶具有較大的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）E001菌株由江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室篩選和保藏；E.coli JM109、E.coli DH5α 為克隆宿主菌，pUCm-T為克隆質(zhì)粒，購(gòu)于上海Sangon公司；P.pastoris GS115為表達(dá)宿主菌，pPIC9K表達(dá)質(zhì)粒，購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 工具酶和試劑

各種限制性內(nèi)切酶、rTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、250 bp DNA Ladder Marker和低分子量蛋白質(zhì)Marker均購(gòu)自TaKaRa公司；YNB、生物素、酵母粉、 蛋白胨、G418、UNIQ-10柱式 Trizol總 RNA抽提試劑盒和EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit購(gòu)自上海Sangon公司；標(biāo)準(zhǔn)反式阿魏酸與阿魏酸甲酯購(gòu)自鹽城朗德化學(xué)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 培養(yǎng)基

種子活化培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）:2%玉米粉，3%豆餅粉，3%KH2PO4，1%CaCl2，1%MgSO4；誘導(dǎo)培養(yǎng)基（用于提 RNA）:0.9%NaNO3，0.05%KH2PO4，0.05%MgSO4，0.4%酵 母 提 取 物 ，20%麩 皮 提 取 液 ；LB、YPD、MD、BMGY和BMMY培養(yǎng)基參考Multi-Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen公司）操作手冊(cè)。

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成

基于宇佐美曲霉與黑曲霉基因序列的相似性[12-13]，參照NCBI上公布的Aspergillus niger CBS 513.88菌株基因組中阿魏酸酯酶A的基因序列，結(jié)合生物信息學(xué)分析的手段，設(shè)計(jì)出一對(duì)擴(kuò)增編碼AusFaeA成熟肽cDNA的特異性上下游引物。

1.5 宇佐美曲霉總RNA的提取

將A.usamii E001接種至種子活化培養(yǎng)基中，于30℃、220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，以3%的接種量轉(zhuǎn)至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于上述條件下振蕩培養(yǎng)24 h后收集菌體，用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取A.usamii的總RNA。

1.6 編碼AusFaeA成熟肽cDNA的克隆及分析

以提取的A.usamii總RNA為模板、Oligo dTAdaptor為引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以其為模板、Fae-F和M13 primer M4為引物進(jìn)行第一輪PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為 50 μL，包括:5×PCR 緩沖液10 μL， 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2 μL，dNTP （2.5 mmol/L） 1.5 μL，F(xiàn)ae-F、M13 Primer M4 各 0.5 μL，rTaq 酶 0.25 μL，雙蒸水 35.25 μL；反應(yīng)條件為:94 ℃ 5 min，30個(gè)循環(huán)（94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s），72 ℃ 10 min。以第一步PCR產(chǎn)物為模板、Fae-F和Fae-R為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94℃5 min，30 個(gè)循環(huán)（94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s），72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，割膠回收目的條帶，具體操作參見(jiàn)EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit說(shuō)明書(shū)。將純化的PCR產(chǎn)物直接與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞；經(jīng)藍(lán)白斑初選、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%瓊脂糖凝膠電泳和PCR鑒定正確后，送上海Sangon公司測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pUCm-T-AusfaeA。最后，將測(cè)得的序列在NCBI上進(jìn)行Blast分析。

1.7 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將測(cè)序驗(yàn)證過(guò)的pUCm-T-AusfaeA用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，割膠回收目的基因AusfaeA，并與經(jīng)同樣雙酶切的pPIC9K質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR篩選鑒定獲重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-AusfaeA后，送上海Sangon公司測(cè)序。

1.8 AusfaeA在畢赤酵母GS115中的表達(dá)

pPIC9K和測(cè)序驗(yàn)證過(guò)的pPIC9K-AusfaeA經(jīng)SalⅠ線性化后，用電穿孔法分別將其導(dǎo)入畢赤酵母GS115中，涂布于MD平板上篩選重組畢赤酵母；將在MD平板上生長(zhǎng)良好的菌落用牙簽點(diǎn)種至含不同濃度G418的YPD平板上篩選抗最高濃度2.0 mg/mL G418的重組畢赤酵母，分別命名為GS115/9K和GS115/AusfaeA；參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》的方法提取重組GS115基因組DNA，利用通用引物5'-AOX和3'-AOX PCR鑒定目的基因是否整合入GS115基因組內(nèi)。GS115/9K和GS115/AusfaeA的常規(guī)表達(dá)參見(jiàn)Multi-Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen公司）操作手冊(cè)。

1.9 reAusFaeA的分離純化與活性測(cè)定

將誘導(dǎo)表達(dá)的發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心5 min后收集上清液，再經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%飽和度（NH4）2SO4鹽析，離心收集沉淀，復(fù)溶于適量20 mmol/L pH 6.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，經(jīng)透析、超濾濃縮（超濾膜的截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 000，Millipore公司）后用Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析柱純化。蛋白質(zhì)濃度測(cè)定采用Bradford法[14]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。采用SDS-PAGE對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析。

以阿魏酸甲酯（MFA）為底物，用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定經(jīng)reAusFaeA水解后的產(chǎn)物中阿魏酸的釋放量。具體步驟按zhang[15]提供的方法稍作修改:移取 900 μL MFA（1 mM，pH 6.0 磷酸鹽緩沖液配制）于2 mL EP管中，45℃保溫10 min，加入100 μL適當(dāng)稀釋的酶液，反應(yīng)10 min后加入400 μL冰乙酸終止反應(yīng)，立即混勻進(jìn)行高效液相色譜分析。以預(yù)先在酶溶液中加入400 μL冰乙酸，再加底物溶液的反應(yīng)物為對(duì)照。在測(cè)定條件下 （45℃、pH 6.0），以每分鐘產(chǎn)生1 μmol阿魏酸所需的酶量為一個(gè)酶活單位（U）。

1.10 reAusFaeA酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

1.10.1 reAusFaeA的最適溫度及溫度穩(wěn)定性 在pH 6.0的條件下反應(yīng)10 min，測(cè)定reAusFaeA在不同溫度下（30～70℃）的酶活性。以某一溫度下的最高酶活性為100%，其他溫度下酶活性與最高酶活性的比值為該溫度下的相對(duì)酶活，繪制溫度-相對(duì)酶活性曲線。將酶液分別置于45、50、55℃下處理10、20、30、40、50、60 min，收取酶液，采用高效液相色譜法測(cè)定殘余酶活性。以0 min分鐘取出酶液的酶活性為100%，殘余酶活與其比值為相對(duì)酶活，繪制時(shí)間-相對(duì)酶活性曲線。

1.10.2 reAusFaeA的最適pH及pH穩(wěn)定性 在最適反應(yīng)溫度下反應(yīng)10 min，測(cè)定reAusFaeA在不同pH值（pH 3.5～7.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液）下的酶活性。以某一pH值下的最高酶活性為100%，其他pH下酶活性與最高酶活性的比值為該pH下的相對(duì)酶活，繪制pH-相對(duì)酶活性曲線。將用不同pH值緩沖液 （pH 3.5～7.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液）稀釋25倍的酶液于35℃保溫1 h，按標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法測(cè)定殘余酶活性。以其中酶活性最高者為100%，其他pH下酶活性與最高酶活性的比值為該pH下的相對(duì)酶活，繪制pH-相對(duì)酶活性曲線。

1.10.3 金屬離子和EDTA對(duì)reAusFaeA酶活性的影響 將酶液與不同金屬離子或EDTA（終濃度為2.0 mmol/L）混勻后于35℃保溫1 h，按標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法測(cè)定殘余酶活性。以只加緩沖液同樣經(jīng)過(guò)35℃保溫1 h的酶活性為100%，來(lái)衡量金屬離子和EDTA對(duì)reAusFaeA酶活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 編碼AusFaeA成熟肽cDNA的克隆及分析

按照1.6中的方法進(jìn)行RT-PCR及PCR反應(yīng)，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到的電泳圖如圖1所示，目的條帶位于800 bp左右的位置，與預(yù)期的基因片段大小相符。將目的條帶割膠回收后與pUCm-T質(zhì)粒進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。最后提取質(zhì)粒進(jìn)行電泳檢測(cè)、PCR鑒定并將帶有目的基因的質(zhì)粒送至上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列相符，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pUCm-T-AusfaeA。Blast分析結(jié)果表明該序列與 Aspergillus niger faeA（Y09330.2）、Aspergillusflavus NRRL3357 faeA（XM_002380132.1）及 Aspergillus oryzae RIB40 faeA（XM_001818700.1）的序列同源性分別為99%、70.9%和70.6%。

圖1 AusfaeAPCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of AusfaeA

2.2 pPIC9K-AusfaeA的構(gòu)建與鑒定

按照1.7中的方法，將pUCm-T-AusfaeA和pPIC9K質(zhì)粒分別用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，酶切后分別進(jìn)行電泳檢測(cè)。前者得到了兩條條帶，一條在2.7 kb左右，另一條位于800 bp左右；后者得到一條位于9 kb左右的條帶。將800 bp和9 kb左右的條帶割膠回收。然后將回收的產(chǎn)物連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。用PCR檢測(cè)的方法篩選目的重組子，將目的重組子送至上海生工進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明基因沒(méi)有發(fā)生突變，且讀碼框完全正確。

2.3 重組GS115的構(gòu)建及高拷貝重組子的篩選與表達(dá)

按照1.8中的方法得到高拷貝的GS115/AusfaeA和GS115/9K重組酵母，提取酵母基因組利用通用引物5'-AOX和3'-AOX做PCR檢測(cè)，如圖2所示，因?yàn)镻.pastoris基因組中本身含有一個(gè)醇氧化酶基因（AOX1），其大小為2.1 kb，而pPIC9k中包含醇氧化酶-1（AOX1）基因的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子（5'AOX1 和 3'AOX1），它們被多克隆位點(diǎn)（MCS）分開(kāi)，外源基因可以在此插入，所以當(dāng)利用通用引物5'-AOX和3'-AOX進(jìn)行PCR鑒定時(shí)，重組GS115均出現(xiàn)兩條條帶，GS115/AusfaeA的PCR產(chǎn)物分別位于2.1 kb和1.3 kb附近，而GS115/9K的PCR產(chǎn)物分別位于2.1 kb和0.5 kb附近，結(jié)果表明AusfaeA已經(jīng)成功整合入畢赤酵母GS115基因組內(nèi)。然后，隨機(jī)挑取鑒定過(guò)的重組酵母菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，8 000 r/min離心5 min收集表達(dá)產(chǎn)物備測(cè)。

圖2 畢赤酵母重組子基因組PCR驗(yàn)證Fig.2 Verification of P.pastoris transformants by PCR

2.4 reAusFaeA的酶活及SDS-PAGE分析

將表達(dá)產(chǎn)物按1.9的方法測(cè)定reAusFaeA的酶活，結(jié)果表明GS115/AusfaeA發(fā)酵上清液中reAusFaeA的酶活可達(dá)到7.05 U/mL，而GS115/9K的發(fā)酵上清液中并未檢測(cè)到阿魏酸酯酶活性。經(jīng)純化后的reAusFaeA比酶活為29.4 U/mg。SDS-PAGE結(jié)果顯示，GS115/AusfaeA的表達(dá)產(chǎn)物在約36 000處可見(jiàn)明顯的特異性目的蛋白條帶 （圖3泳道2-3），而GS115/9K的表達(dá)產(chǎn)物在該處并無(wú)特異性條帶（圖3泳道1）。結(jié)果表明reAusFaeA的表觀分子量高于理論計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量（28 300）。這可能由于reAusFaeA在P.pastoris表達(dá)過(guò)程中發(fā)生了糖基化或磷酸化等翻譯后修飾。用軟件NetNGlyc 1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/） 和 NetOGlyc 3.1 （http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/） 分 別對(duì)N和O糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明AusFaeA氨基酸序列中含有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。

圖3 reAusFaeA的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of reAusFaeA

2.5 reAusFaeA的酶學(xué)鑒定

按照1.10.1中的方法測(cè)定reAusFaeA的最適溫度及溫度穩(wěn)定性。結(jié)果表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為45℃，在40～50℃的范圍內(nèi)催化活性較高 （圖4）；由圖5可以看出，該酶在45℃的條件下相當(dāng)穩(wěn)定，處理60 min殘余酶活仍能達(dá)到89.3%；當(dāng)溫度高于45℃時(shí)，殘余酶活下降較快，在55℃下處理20 min后殘余酶活性僅為7.91%。這也說(shuō)明該酶的熱穩(wěn)定性有待進(jìn)一步地提高。

圖4 溫度對(duì)reAusFaeA酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of the reAusFaeA

圖5 reAusFaeA的溫度穩(wěn)定性Fig.5 Effect of temperature on enzyme stability

按照1.10.2中的方法測(cè)定reAusFaeA的最適pH及pH穩(wěn)定性。結(jié)果表明，該酶的最適pH為5.0，當(dāng)pH低于3.5和高于7.5時(shí)該酶幾乎沒(méi)有催化活性（圖6）。由圖7可知，該酶在pH 4.0～6.0的范圍內(nèi)處理1 h后殘余酶活仍能達(dá)到60%以上；當(dāng)pH值低于4.0和高于6.5時(shí)該酶的穩(wěn)定性較差。

圖6 pH對(duì)reAusFaeA酶活力的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of the reAusFaeA

圖7 reAusFaeA的pH穩(wěn)定性Fig.7 Effect of pH on enzyme stability

按照1.10.3中的方法，研究了不同金屬離子及EDTA對(duì)reAusFaeA酶活性的影響。結(jié)果表明，大多數(shù)被測(cè)的金屬離子及EDTA對(duì)該酶的活性影響不大，說(shuō)明該酶具有被廣泛應(yīng)用的潛力。

圖8 金屬離子和EDTA對(duì)AusFaeA酶活力的影響Fig.8 Effects of various metal ions and EDTA on the activity of the reAusFaeA

3 結(jié)語(yǔ)

阿魏酸酯酶有著重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，通過(guò)基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)阿魏酸酯酶的異源高效表達(dá)是降低其工業(yè)應(yīng)用成本、適應(yīng)工業(yè)應(yīng)用條件的有效手段。國(guó)內(nèi)對(duì)于阿魏酸酯酶異源表達(dá)的相關(guān)報(bào)道較少。Mathew等[16]對(duì)Aspergillus flavipes進(jìn)行了液體深層發(fā)酵獲取了阿魏酸酯酶，以阿魏酸甲酯為底物，最高酶活可達(dá)6.82 U/mL。

作者首次成功實(shí)現(xiàn)了AusfaeA在P.pastoris GS115中的分泌表達(dá)，畢赤酵母是一個(gè)優(yōu)良的表達(dá)體系，其具有操作簡(jiǎn)便、可高水平地胞外表達(dá)、可進(jìn)行糖基化、二硫鍵形成等真核翻譯后修飾等優(yōu)點(diǎn)[17]。以阿魏酸甲酯為底物，reAusFaeA粗酶液的酶活可達(dá)到7.05 U/mL，經(jīng)純化后，該酶的比酶活為29.4 U/mg；SDS-PAGE表明出reAusFaeA的表觀分子量約為36.0 kDa；初步的酶學(xué)性質(zhì)研究表明該酶的最適反應(yīng)溫度為45℃，并在45℃下相當(dāng)穩(wěn)定；最適反應(yīng)pH為5.0，在pH 4.0～6.0的條件下處理1 h仍有60%以上的殘余酶活；EDTA和大多數(shù)被測(cè)金屬離子對(duì)該酶的活性影響不大；這些優(yōu)良的酶學(xué)特性表明了該酶具有被廣泛應(yīng)用的潛力。遺憾的是，該酶在55℃的條件下處理20 min后殘余酶活性僅為7.91%，表明該酶的熱穩(wěn)定性較差。若要將其與某些耐熱的木聚糖酶共同使用，今后還需對(duì)其熱穩(wěn)定性進(jìn)行必要的理性改造。

[1]許暉，孫蘭萍，張斌，等.微生物阿魏酸酯酶的研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2008，10:11-15.XU Hui，SUN Lan-ping，ZHANG Bin，et al.Advance research on feruloyl esterases produced by microbes[J].China Brewing，2008，10:11-15.（in Chinese）

[2]Vries RP.DE，Visser J.Aspergillus enzymes involved in degradation of plant cell wall polysaccharides[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews，2001，65（4）:497-522.

[3]Luonteri E，Kroon P A，Tenkanen M，et al.Activity of an Aspergillus terreus α-arabinofuranosidase on phenolic-substituted oligosaccharides[J].Journal of Biotechnology，1999，67:41-48.

[4]Kroon PA，Garcia－Conesa MT，F(xiàn)illingham IJ，et al.Release of ferulic acid dehydrodimers from plant cell walls by feruloyl esterases[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，1999，79:428-434.

[5]Crepin V F，F(xiàn)aulds C B，Connerton I F.Functional classification of the microbial feruloyl esterases[J].Appl Microbiol Biotechnol，2004，63:647-652.

[6]Williamson G J，F(xiàn)aulds C B.The purification and characterization of 4-hydroxy-3-methoxycinnamic （ferulic） acid esterase from Streptomyces olivochromogenes[J].Joumal of General Microbiology，1991，137:2339-2345.

[7]胡雪松，李夏蘭.阿魏酸酯酶基因克隆表達(dá)調(diào)控及其應(yīng)用進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2009，12:11-16.HU Xue-song，LI Xia-lan.Review on cloning，expression，regulation and applicationsof feruloyl esterase genes[J].Biotechnology Bulletin，2009，12:11-16.（in Chinese）

[8]劉晶晶，曹陽(yáng)春，楊紅建.阿魏酸酯酶表達(dá)體系與酶蛋白拓?fù)淇臻g結(jié)構(gòu)分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2009，36（12）:26-30.LIU Jing-jing，CAO Yang-chun，YANG Hong-jian.Ferulic acid esterase expression system and enzyme protein topology analysis of the spatial structure[J].China Animal Husbandry And Veterinary Medicine，2009，36（12）:26-30.（in Chinese）

[9]Nethaji B M，Pattabhi V.Structure of 3-（4-hydroxy-3-rnethoxyphenyl）-2-propenoic acid （ferulic acid）.ActaCryst，1988，C44:275-277.

[10]劉子立，歐仕益.離子交換法純化阿魏酸的研究[J].廣州食品工業(yè)科技，2003，20:44-47.LIU Zi-li，OU Shi-yi.Extraction of ferulic acid from enzymatic hydrolysate by using ion-exchange adsorption[J].Guangzhou Food Science and Technology，2003，20:44-47.（in Chinese）

[11]李夏蘭，程珊影，楊道秀，等.阿魏酸酯酶和木聚糖酶協(xié)同降解麥糟[J].化工進(jìn)展，2012，31（5）:1096-1102.LI Xia-lan，CHEN Shan-ying，YANG Dao-xiu，et al.Utilization of feruloyl esterase and xylanase for the degradation of brewers’spent grain[J].Chemical Industry And Engineering Progress，2012，31（5）:1096-1102.（in Chinese）

[12]Li J F，Zhao S G，Tang C D，et al.Cloning and functional expression of an acidophilic beta-mannanase gene （Anman5A） from Aspergillus niger LW-1 in Pichia pastoris[J].Journal Of Agricultural And Food Chemistry，2012，60（3）:765-773.

[13]Tang C D，Guo J，Wu M C，et al.Cloning and bioinformatics analysis of a novel acidophilic β-mannanase gene，Auman5A，from Aspergillus usamii YL-01-78[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2011，27（12）:2921-2929.

[14]Bradford M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding[J].Analytical Biochemistry，1976，72:248-254.

[15]Zhang S B，Pei X Q，Wu Z L.Multiple amino acid substitutions significantly improve the thermostability of feruloyl esterase A from Aspergillus niger[J].Bioresource Technology，2012，117:140-147.

[16]Mathew S，Abraham T E.Studies on the production of feruloyl esterase from cereal brans and sugar cane bagasse by microbial fermentation[J].Enzyme and Microbial Technology，2005，36:565-570.

[17]諶斌，唐雪明，沈微，等.粗糙脈孢菌漆酶基因的克隆及在畢赤酵母中的初步表達(dá)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，23（4）:43-47.CHEN Bin，TANG Xue-ming，SHEN Wei，et al.Cloning of a laccase gene from Neurospora crassa and it’s preliminary expression in Pichia pastoris[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2012，23（4）:43-47.（in Chinese）