吳學(xué)兵，陸 彬，桂曉虹，江 淵，張國(guó)英，王 宏

(1.上海市第七人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200137;2.上海市松江區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201600;3.上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防治科，上海200336)

目前結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)診斷方法以涂片抗酸染色和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)為主，在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)中，以固體羅氏(L-J)培養(yǎng)法為經(jīng)典方法，但需4～8周時(shí)間，而液體培養(yǎng)中多需要昂貴的設(shè)備，不適合在基層醫(yī)院推廣，液體分枝桿菌培養(yǎng)管(MGIT)培養(yǎng)法對(duì)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)具有操作簡(jiǎn)單、方便易行、報(bào)陽(yáng)時(shí)間比固體L-J培養(yǎng)法短等優(yōu)點(diǎn)，本研究將液體MGIT培養(yǎng)法與固體L-J培養(yǎng)法進(jìn)行比較，以評(píng)估液體MGIT培養(yǎng)法在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用。

材料和方法

一、材料

1.標(biāo)本來(lái)源 收集2010年11月至2011年8月上海松江區(qū)中心醫(yī)院肺結(jié)核門診和住院的疑似或確診后治療復(fù)診的患者痰標(biāo)本共1598例，其中828例為疑似新發(fā)患者標(biāo)本，770例為已確診后復(fù)診的患者標(biāo)本，結(jié)核病是根據(jù)衛(wèi)生部發(fā)布的 WS288-2008《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》[1]中臨床癥狀、體征及胸部影像學(xué)檢查等確診。

2.儀器與試劑 抗酸染液購(gòu)自珠海BASO公司，固體L-J培養(yǎng)基為上海奧普生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)的中性改良羅氏培養(yǎng)基，液體MGIT培養(yǎng)基為美國(guó)BD公司生產(chǎn)的MGIT培養(yǎng)管(手工法)，以上試劑均為上海市疾病預(yù)防控制中心(CDC)結(jié)核病防治科統(tǒng)一提供。美國(guó)BD公司BACTEC MicroMGIT熒光判讀儀、Eppendorf Centrfuge 5810型離心機(jī)。

二、方法

1.標(biāo)本留取 囑患者留晨、晚間痰和即時(shí)痰3次，涂片染色操作和質(zhì)控方法參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[2]及文獻(xiàn)報(bào)道[3]進(jìn)行，涂片統(tǒng)計(jì)陰、陽(yáng)性時(shí)以患者3次送檢中有1次痰檢陽(yáng)性即統(tǒng)計(jì)為陽(yáng)性。

2.標(biāo)本前處理和分離培養(yǎng) 無(wú)菌取痰標(biāo)本1～2 mL(送3次痰標(biāo)本將其混和后再取)于50 mL帶蓋的尖底離心管中，先用1～2倍體積N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH法(NaOH-NALC)前處理液消化15～20 min，加入pH值6.8磷酸鹽緩沖液(PBS)至 50 mL，3000×g 離心 15 min，再棄上清，沉淀用pH值6.8 PBS 0.7 mL制備成懸濁液，取0.1 mL沉淀物接種到中性固體L-J培養(yǎng)基中，同時(shí)取0.5 mL接種MGIT中，于標(biāo)本接種MGIT前在每一個(gè)MGIT中加入0.5 mL營(yíng)養(yǎng)添加劑(OADC)和0.1 mL以無(wú)菌蒸餾水溶解的雜菌抑制劑(PANTA)，2種培養(yǎng)管均置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，次日起開(kāi)始觀察菌生長(zhǎng)情況，L-J培養(yǎng)用肉眼觀察，液體培養(yǎng)用手工MGIT熒光讀數(shù)儀進(jìn)行判讀，2種方法所有陰性培養(yǎng)管繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)和讀管持續(xù)8周(判讀儀判讀時(shí)持續(xù)讀管6周)。MGIT陰性培養(yǎng)管應(yīng)在丟棄前再觀察管內(nèi)的混濁或小顆粒的情況，檢測(cè)出的陽(yáng)性培養(yǎng)均涂片抗酸染色確認(rèn)。

3.質(zhì)控 涂片染色每周用上海市臨床檢驗(yàn)中心抗酸染色陰陽(yáng)性片做平行檢測(cè)合格，室間質(zhì)評(píng)定期隨機(jī)涂片抽樣送上海市CDC參加盲法復(fù)檢評(píng)估，各項(xiàng)指標(biāo)合格。固體L-J培養(yǎng)法和液體MGIT培養(yǎng)法所有陽(yáng)性培養(yǎng)標(biāo)本均送上海市CDC結(jié)核病防治科確認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用PEMS 3.1醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、2種培養(yǎng)法對(duì)分枝桿菌培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)時(shí)間

對(duì)疑似新發(fā)230株、復(fù)診58株確診的患者來(lái)自同一痰標(biāo)本均出現(xiàn)培養(yǎng)陽(yáng)性，其報(bào)陽(yáng)時(shí)間進(jìn)行比較，在疑似新發(fā)230例中，液體MGIT培養(yǎng)法報(bào)陽(yáng)時(shí)間為 4 ～22 d[(13.63 ±7.14)d]，明顯低于固體 L-J培養(yǎng)法[17～40 d，(28.67 ±10.04)d，P＜0.05)]。在復(fù)診的58例中液體MGIT培養(yǎng)法報(bào)陽(yáng)時(shí)間為12 ～33 d[(22.94 ±9.55)d]，明顯低于固體L-J培養(yǎng)法[18～40 d，(28.53±10.40)d，P＜0.05)]，液體MGIT培養(yǎng)法中疑似新發(fā)和復(fù)診患者的報(bào)陽(yáng)天數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，固體L-J培養(yǎng)法中疑似新發(fā)和復(fù)診患者的報(bào)陽(yáng)天數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

二、涂片及2種培養(yǎng)法對(duì)分枝桿菌陽(yáng)性率和2種培養(yǎng)法的污染率

對(duì)1598例痰標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行涂片抗酸染色法、液體MGIT培養(yǎng)法和固體L-J培養(yǎng)法檢測(cè)，在陽(yáng)性率上，液體MGIT培養(yǎng)法的總陽(yáng)性率21.09%(337/1598)、疑似新發(fā)陽(yáng)性率32.00%(265/828)、確診治療后復(fù)診痰培養(yǎng)陽(yáng)性率9.30%(72/770)，與固體L-J培養(yǎng)法總陽(yáng)性率 10.51%(168/1598)、疑似新發(fā)陽(yáng)性率 17.90%(148/828)，確診治療后復(fù)診痰培養(yǎng)陽(yáng)性率2.60%(20/770)以及和涂片抗酸染色法總陽(yáng)性率 10.63%(170/1598)、疑似新發(fā)陽(yáng)性率14.80%(123/828)比較均高(P＜0.05)，但在確診治療后復(fù)診患者痰液體MGIT培養(yǎng)法陽(yáng)性率與涂片抗酸染色法陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);另一方面，固體L-J培養(yǎng)法和涂片抗酸染色法陽(yáng)性率比較，除確診治療后復(fù)診痰涂片抗酸染色法陽(yáng)性率6.1%(47/770)比固體L-J培養(yǎng)法2.60%(20/770)高(P＜0.05)外，其余的固體L-J培養(yǎng) 法和涂片抗酸染色陽(yáng)性率在總陽(yáng)性率、疑似新發(fā)陽(yáng)性率上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在液體MGIT培養(yǎng)法和固體L-J培養(yǎng)法污染率上，MGIT培養(yǎng)法污染率為6.57%(105/1598)，比固體 L-J培養(yǎng)法污染率[4.00%(64/1598)]高(P ＜0.05)。

討 論

目前結(jié)核病的傳播和治療是一個(gè)世界性的難題，備受關(guān)注，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)是結(jié)核病診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷如涂片抗酸染色法存在陽(yáng)性率低的問(wèn)題，我們之前研究初次確診的結(jié)核病患者痰涂片抗酸染色法陽(yáng)性率為39.4%[3]，且不能確診和做藥物敏感性試驗(yàn)，固體L-J培養(yǎng)法痰細(xì)菌報(bào)陽(yáng)時(shí)間需4～8周，陽(yáng)性率為44.3%，嚴(yán)重影響了患者的診斷和治療;液體培養(yǎng)瓶(儀器法)需要昂貴的設(shè)備，不宜在基層醫(yī)院推廣，而液體MGIT培養(yǎng)法原理為MGIT底部包埋有熒光物質(zhì)，熒光物質(zhì)會(huì)隨著管內(nèi)氧含量的變化而發(fā)生反應(yīng)，若有分枝桿菌在MGIT內(nèi)生長(zhǎng)消耗氧，管內(nèi)熒光物質(zhì)就會(huì)被激活，在特定光源的激發(fā)下釋放熒光，只需用長(zhǎng)波紫外燈或用手工MGIT熒光讀數(shù)儀判讀，操作簡(jiǎn)單、方便易行。

本研究發(fā)現(xiàn)，疑似新發(fā)患者標(biāo)本液體MGIT培養(yǎng)法報(bào)陽(yáng)時(shí)間為(13.63±7.14)d，固體 L-J培養(yǎng)法報(bào)陽(yáng)時(shí)間為(28.67±10.04)d，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);復(fù)診患者標(biāo)本液體MGIT培養(yǎng)法報(bào)陽(yáng)時(shí)間為(22.94 ±9.55)d，與固體 L-J培養(yǎng)法[(28.53 ±10.40)d]差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，雖復(fù)診患者經(jīng)治療后細(xì)菌生長(zhǎng)慢且難，液體MGIT培養(yǎng)法在復(fù)診患者報(bào)陽(yáng)時(shí)間上比固體L-J培養(yǎng)法平均可縮短1周左右。

從3種方法檢出結(jié)核分枝桿菌的陽(yáng)性率上可以看出，在無(wú)論疑似新發(fā)和復(fù)診患者的陽(yáng)性率對(duì)比上，初診液體MGIT培養(yǎng)法陽(yáng)性率為32.00%(255/828)，比涂片抗酸染色法14.8%(265/828)和固體L-J培養(yǎng)法的17.9%(148/828)陽(yáng)性率都高(P ＜0.05)，與文獻(xiàn)報(bào)道[4]基本一致，涂片抗酸染色法和固體L-J培養(yǎng)法在疑似新發(fā)患者痰培養(yǎng)中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，與本實(shí)驗(yàn)室之前研究[3]基本一致，但在復(fù)診的患者痰菌檢驗(yàn)中，液體MGIT培養(yǎng)法陽(yáng)性率為9.3%(72/770)，與涂片抗酸染色法6.1%(47/770)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，與固體 L-J培養(yǎng)法的陽(yáng)性率2.6%(20/770)相比較高(P ＜0.05)，其原因可能與復(fù)診患者經(jīng)抗結(jié)核治療后一方面可能是無(wú)活性或活性差，如用藥后L型的形成等因素，同時(shí)菌量少，不能或難以在一般培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但涂片可查見(jiàn)，另一方面液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分和環(huán)境不一樣[5-6]，同樣顯示了液體培養(yǎng)基優(yōu)于固體L-J法，也說(shuō)明了復(fù)檢患者痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的分離培養(yǎng)更適于采用液體培養(yǎng)法。

液體MGIT培養(yǎng)法污染率為6.57%(105/1598)，比固體 L-J培養(yǎng)法污染率[4.0%(64/1598)]高(P ＜0.05)，比李靜等[4]報(bào)道的 3.0%高，比國(guó)外的9.7%低[7]，在觀察和分析實(shí)際操作中降低污染率的改進(jìn)環(huán)節(jié)很多，如嚴(yán)格在配制pH值8.6 PBS上或其他添加劑上注意無(wú)菌操作，在標(biāo)本處理和消化上充分震蕩混勻，將黏液塊打碎，所有的加樣槍定期消毒，加樣吸頭高壓滅菌和使用一次性移液管與吸管，生物安全柜內(nèi)要加強(qiáng)消毒措施等，同時(shí)優(yōu)化操作流程等都會(huì)在降低污染率上發(fā)揮一定的作用。

總之，液體MGIT培養(yǎng)法無(wú)論從提高陽(yáng)性率、縮短報(bào)陽(yáng)時(shí)間上都優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，而且操作簡(jiǎn)便，不需要昂貴的設(shè)備，在基層醫(yī)院易于進(jìn)行操作和推廣，本研究今后將在進(jìn)一步控制和降低污染率上探索出更有效的措施和辦法。

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[S].WS288-2008，中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，2008.

[2]中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì).結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程[M].北京:中國(guó)教育文化出版社，2006:8-45.

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