陳伶利，李 杰

(湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208)

細菌耐藥性是指細菌對抗菌藥物的相對抗性。如果從弗萊明1929年發(fā)表《論青霉菌培養(yǎng)物的抗菌作用》論文算起，抗菌藥物與病菌之間的“拉鋸戰(zhàn)”已有80年。人類為了對付層出不窮的致病微生物，不斷研發(fā)出各類新型抗菌藥物。而細菌為了生存，不斷變異進化，形成可耐受多種抗菌藥物的多重耐藥細菌，典型的代表菌如大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌等[1]。細菌耐藥性已成為21世紀全球關(guān)注的熱點，我們主要對大腸埃希菌外排系統(tǒng)與多重耐藥最新進展進行綜述。

一、大腸埃希菌的耐藥機制

細菌的耐藥機制非常復(fù)雜，從遺傳學角度來說，細菌的耐藥分為固有性耐藥和獲得性耐藥。前者來源于該細菌本身染色體上的耐藥基因，代代相傳，具有典型的種屬特異性;而后者是由于細菌在生長繁殖過程中，其DNA發(fā)生改變而使其形成或獲得了耐藥性表型，介導DNA改變的因素包括染色體突變和質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等介導的耐藥基因的獲得。一直以來，人們都認為細菌的耐藥性是隨著抗菌藥物的使用而后天獲得的一種能力，但是最新的研究表明，這種能力是先于現(xiàn)代抗菌藥物選擇壓力之前細菌本身所固有的。來自加拿大麥克馬斯特大學的研究人員在距今3萬年以前的古細菌體內(nèi)，首次發(fā)現(xiàn)了多種抗菌藥物的耐藥基因[2]。但耐藥基因是如何轉(zhuǎn)移的，還有待于研究。

細菌的耐藥可由滅活酶或鈍化酶的產(chǎn)生、細胞膜通透性的改變、藥物作用靶位的改變、細菌自身代謝狀態(tài)改變、細菌生物被膜的形成、多重藥物外排機制等多因素引起。對于細菌來說，外排基因占所有轉(zhuǎn)運蛋白基因的6% ～18%，所以外排基因編碼的外排泵是導致其多重耐藥的重要機制。如最新研究表明結(jié)核分枝桿菌對異煙肼和乙氨丁醇的耐受就是由一種藥物外排基因jefA引起的[3]。而耐藥菌株陰溝腸桿菌對喹諾酮的抗性也是由多藥及毒性化合物外排家族(mutidrug and toxic compound extrusion，MATE)主動外排藥物所介導[4]。對于大腸埃希菌來說，其表達的AcrABTolC外排泵更是被作為外排系統(tǒng)的經(jīng)典模型來研究。研究結(jié)果也表明，臨床分離的多重耐藥的大腸埃希菌，其耐藥性往往與某些基因的超表達相關(guān)，而這些基因是調(diào)控多重藥物外排泵的轉(zhuǎn)錄因子，能上調(diào)多重藥物外排泵AcrAB-TolC和下調(diào)膜蛋白的通透性[5-6]。所以，以下我們將詳細介紹引起大腸埃希菌多重耐藥的外排系統(tǒng)。

二、大腸埃希菌主動外排泵

細菌轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)相當復(fù)雜，從細菌轉(zhuǎn)運體進化與功能角度來看，與抗菌藥物耐藥性有關(guān)的主動外排泵系統(tǒng)主要歸為以下5個家族:三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)結(jié)合盒超家族(ATP-binding cassettes[ABC]transporters，ABC)、小多重耐藥家族(small multidrug resistance，SMR)、主要易化子超家族(major facilitator superfamily，MFS)、MATE和耐藥節(jié)結(jié)化細胞分化家族(resistance nodulation cell division，RND)[7]。以上各類轉(zhuǎn)運體中，除ABC家族以ATP作為能源外排藥物，MATE家族以鈉離子或質(zhì)子驅(qū)動力為能量外，其余各類均以質(zhì)子驅(qū)動力為能量并形成質(zhì)子與藥物的反轉(zhuǎn)運體，即質(zhì)子與藥物在轉(zhuǎn)運過程中，質(zhì)子進入胞內(nèi)而藥物被排至胞外。以下將對每個外排家族的功能進行介紹。

1.ABC ABC家族能介導一系列藥物的外排。細菌中很多外排泵屬于這一類型，如金黃色葡萄球菌的 AbcA、Sav1866，鼠傷寒沙門菌的MacAB，肺炎鏈球菌的PatA、PatB、SP2073/SP2075，結(jié)核分枝桿菌的 Rv0194、Rv1258C、Rv2686c、Rv2687c、Rv2688c等。對于大腸埃希菌來說，2005年Salomón帶領(lǐng)的團隊在其體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個屬于 ABC 的外排泵——YojI[8]，雖然該外排泵的具體結(jié)構(gòu)還不是很清楚，但研究結(jié)果表明，其與外膜蛋白TolC聯(lián)合后可介導多肽類抗菌藥物小菌素J25的外排[9]。亮氨酸應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白能誘導YojI的表達，如果亮氨酸應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白被抑制，則會導致YojI表達受阻。最近在嗜麥芽窄食單胞菌中發(fā)現(xiàn)一個ABC外排家族的新成員，命名為SmrA，該外排泵能增加大腸埃希菌對氟喹諾酮類、四環(huán)素、阿霉素及多種染料分子等物質(zhì)的抗性，甚至還能減少大腸埃希菌對諾氟沙星的攝入及增加其外排[10]。

2.SMR SMR家族的成員超過250個，在這些外排成員中，有的是由染色體編碼，如在鮑曼不動桿菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的AbeS[11]，也有的是由質(zhì)粒編碼。SMR主要外排一些殺毒劑以及氨基糖苷類抗菌藥物。大腸埃希菌的EmrE是SMR的典型外排泵，其是一個由4個穿膜蛋白構(gòu)成的同源二聚體并以此形式來發(fā)揮作用。雖然EmrE外排泵只能將其底物分子外排到其膜間隙，但其與AcrAB-TolC之類的RND外排泵聯(lián)合作用仍然可以引起對底物分子的超強耐受性。在大腸埃希菌中還存在很多SMR外排泵如Mef(B)、QepA、QepA2等，他們都是由質(zhì)粒編碼的外排泵，前者可以外排一些重金屬鹽[12]，而后兩者都能介導氟喹諾酮類藥物的耐藥[13-14]。

3.MFS 這也是一個很龐大的家族，細菌的很多外排泵都有此家族，包括鮑曼不動桿菌的SmvA、幽門螺桿菌的 Hp1181、枯草芽孢桿菌的Bmr和LmrB、金黃色葡萄球菌的 NorA和 QacA等。關(guān)于MFS的最新研究是在鮑曼不動桿菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個新的MFS外排家族成員AmvA，其能介導藥物及殺菌劑的外排[15]。這些外排泵多數(shù)屬于逆向轉(zhuǎn)運蛋白單體，但在革蘭陰性細菌中發(fā)現(xiàn)的MFS外排泵卻屬于由轉(zhuǎn)運蛋白、膜融合蛋白和外膜蛋白共同組成的三聯(lián)復(fù)合體，大腸埃希菌的EmrAB-TolC和EmrKY-TolC就是其中的典型代表。這種復(fù)合體轉(zhuǎn)運機制比起單個轉(zhuǎn)運蛋白對底物的轉(zhuǎn)運效率要高一些，因為單個轉(zhuǎn)運蛋白僅能將底物分子運送到膜的周質(zhì)空間，然后再由別的外排泵轉(zhuǎn)運出去。目前已有很多MFS轉(zhuǎn)運體晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)非常清楚，如大腸埃希菌多重耐藥外排泵EmrD，其能介導一系列疏水性分子的外排，如十二烷基磺酸鈉、苯甲羥氨等。在霍亂弧菌體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了EmrD-3外排泵，將該外排泵基因重組到大腸埃希菌體內(nèi)能明顯增加細胞對藥物的耐受能力，其中對利奈唑酮的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentrations，MIC)值升高最明顯，可達 102 倍(MIC=256 mg/mL)[16]。結(jié)構(gòu)研究表明，在EmrD內(nèi)部有一個由疏水殘基構(gòu)成的疏水性很強的結(jié)構(gòu)，并向細胞內(nèi)膜內(nèi)側(cè)伸出2個長環(huán)結(jié)構(gòu)，該環(huán)能識別底物分子[17]。

4.MATE 這個家族能介導細菌對一系列包括氟喹諾酮類在內(nèi)的陽離子毒性藥物的耐受，但他的底物類型卻比其他外排家族少很多。要通過質(zhì)子或鈉離子與藥物的反向轉(zhuǎn)運來提供能量。以副溶血性弧菌NorM外排泵為代表[18]，雖然目前報道的MATE家族成員大約只有20個，但是幾乎在所有生物體內(nèi)都存在MATE蛋白，如在人類染色體上就發(fā)現(xiàn)了編碼MATE蛋白的基因hMATE1和 hMATE17，將hMATE1在HEK293細胞中表達后，能介導有機陽離子和質(zhì)子的交換[19]。

5.RND RND外排家族是廣泛分布在革蘭陰性細菌體內(nèi)的一類外排系統(tǒng)，其能主動外排抗菌藥物和一些化學試劑。有研究顯示RND的主動外排泵系統(tǒng)與細菌多重耐藥性密切相關(guān)。大腸埃希菌中此家族包括7個 RND轉(zhuǎn)運體，其中AcrAB、AcrEF、AcrD、YhiUV、MdtABC 與藥物的排出有關(guān)，他們都需與外膜蛋白TolC聯(lián)合，并通過TolC的開放外排不同的藥物分子[20]。AcrABTolC外排系統(tǒng)是大腸埃希菌中最重要的外排系統(tǒng)，在大腸埃希菌的先天性耐藥中起著顯著的作用。近年來對他的結(jié)構(gòu)和外排機制進行了深入的研究。AcrAB-TolC外排泵是由3個配體蛋白構(gòu)成的三聯(lián)體復(fù)合物，包括位于細胞內(nèi)膜上的“輸送器”(AcrB)、錨定在外膜上的“出口通道”(TolC)以及橫跨周質(zhì)空間的“轉(zhuǎn)接蛋白AcrA”[21-22]。AcrA通過脂肪酸鏈連接在內(nèi)膜上，并通過發(fā)卡結(jié)構(gòu)連接在“出口導管”的雙螺旋區(qū)域。他的作用主要是協(xié)調(diào)AcrB和TolC之間的相互作用，Tikhonova等[23]采用表面等離子體技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，AcrA上與細胞膜鄰近的結(jié)構(gòu)域部分的構(gòu)象對AcrAB-TolC復(fù)合體的形成至關(guān)重要，并將作為新的抑制劑研發(fā)的靶點。內(nèi)膜蛋白AcrB能識別外排藥物，并通過構(gòu)象改變形成質(zhì)子和藥物分子逆向轉(zhuǎn)運的能量轉(zhuǎn)化體[24]，他與藥物分子具有很高的親和性，其基因的突變會導致大腸埃希菌對鄰氯青霉素MIC值下降512倍[25]。除此以外，AcrB還能與新生霉素、MC-207110等外排泵抑制劑結(jié)合，但此結(jié)合并不會影響其與AcrA、TolC的相互作用[23]。外膜蛋白TolC是位于外膜上的孔道蛋白，上端為開放結(jié)構(gòu)，以便給外排底物提供泵出的寬闊通道;下端為封閉結(jié)構(gòu)。三聯(lián)復(fù)合物構(gòu)象的改變，可使孔道定期開放或閉合。TolC錯誤的開放會引起他們?nèi)呦嗷プ饔玫臏p弱甚至三聯(lián)復(fù)合物的解體[26]。TolC除了在外排藥物中發(fā)揮作用外，研究還發(fā)現(xiàn)其與大腸埃希菌耐受極酸性環(huán)境有關(guān)[26]。在對大腸埃希菌AcrAB-TolC的外排路徑的研究中發(fā)現(xiàn)，AcrB識別藥物分子，并引起其構(gòu)象改變，形成一條藥物分子進出的通道，AcrB構(gòu)象的改變會帶動 AcrA和TolC相互作用，開放TolC通道。DARPin能抑制AcrA與AcrB的相互作用，從而引起通道TolC錯誤的開放，使他們?nèi)呦嗷プ饔脺p弱甚至復(fù)合物的解體[23]。對于藥物分子而言，他們先與 AcrB的“較低裂縫 ”部位結(jié)合，然后通過“結(jié)合口袋”運輸?shù)健巴ǖ来箝T”，最后到達連接AcrB與TolC的“漏斗部位”，經(jīng)TolC通道排出細胞[27]。

三、展望

大腸埃希菌是重要的條件致病菌，其外排系統(tǒng)在其多重耐藥中起到非常重要的作用。在過去10多年中，人們主要對大腸埃希菌外排泵的結(jié)構(gòu)和功能進行了研究。隨著研究的深入，新外排泵不斷被開發(fā)，外排泵的結(jié)構(gòu)不斷被破解，這對解決日益嚴重的耐藥問題具有重要的意義。在這些研究中，很少有針對外排泵分子機制的研究，如果更多地關(guān)注外排泵的三維結(jié)構(gòu)、外排泵-底物復(fù)合物的合成以及動力學特征的研究，將有助于選擇外排機制中的新目標，從而開發(fā)出具有臨床意義的耐藥性抑制劑。

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