丁正峰，薛暉，王曉豐，唐建清

(1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京210017;2.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京210097)

克氏原螯蝦Procambarus clarkii 也稱(chēng)小龍蝦，是近年來(lái)最具特色、最具潛力的養(yǎng)殖品種之一［1-3］。隨著養(yǎng)殖集約化程度的不斷提升，產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展中也凸顯諸多問(wèn)題，養(yǎng)殖水體的污染即為其中之一。稻蝦輪作是目前大量采用的克氏原螯蝦養(yǎng)殖模式，即在水稻收割后至翌年播種這段閑置時(shí)間，在稻田中放養(yǎng)克氏原螯蝦。由于在農(nóng)作物病蟲(chóng)害防治過(guò)程中，噴施的農(nóng)藥量平均只有25% ～50%沉積在作物上［4］，大部分進(jìn)入農(nóng)田土壤及水體，且部分農(nóng)藥在水中降解速度較慢［5］，極易對(duì)稻田水中的克氏原螯蝦產(chǎn)生毒性，筆者所在課題組已先后多次接到疑因農(nóng)藥污染而導(dǎo)致克氏原螯蝦死亡的報(bào)告。

樂(lè)斯本(Lorsban，LSB)又名毒死蜱(Chlorpyrifos)，世界衛(wèi)生組織(WHO)將其列為二級(jí)中度危害殺蟲(chóng)劑，LSB是目前全球應(yīng)用最廣泛的農(nóng)藥之一［6-7］。在中國(guó)，2007年甲胺磷等高毒農(nóng)藥被禁用后，樂(lè)斯本作為替代產(chǎn)品在水稻等作物上的用量大幅增加，銷(xiāo)售額居所有殺蟲(chóng)劑首位［8］。因此，了解LSB 對(duì)水環(huán)境的污染程度以及對(duì)克氏原螯蝦的養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)非常必要。

LSB 對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種及水環(huán)境的危害性是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一，但主要集中在對(duì)大型溞、輪蟲(chóng)、魚(yú)類(lèi)及南美白對(duì)蝦等［7，9-14］的研究上，對(duì)克氏原螯蝦毒性方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。LSB 同其他有機(jī)磷類(lèi)(OP)農(nóng)藥一樣，會(huì)對(duì)生物體造成氧化脅迫，破壞氧自由基的代謝平衡，造成機(jī)體損傷［15］，而肝臟是機(jī)體最重要的解毒器官，對(duì)LSB 的親和力較大，藥物會(huì)通過(guò)不斷被攝取而迅速積累［16］。本試驗(yàn)中，作者選擇克氏原螯蝦肝胰臟組織，通過(guò)檢測(cè)肝胰臟內(nèi)重要的抗氧化酶組分——超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性及谷胱甘肽(GSH)含量的變化［17］，研究了急性暴露對(duì)克氏原螯蝦肝胰臟抗氧化系統(tǒng)的影響，旨在為合理地使用LSB 農(nóng)藥、開(kāi)展克氏原螯蝦的生態(tài)養(yǎng)殖和水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

克氏原螯蝦取自江蘇省淡水水產(chǎn)研究所盱眙試驗(yàn)基地，體質(zhì)量為(20.0 ±1.7)g，頭胸甲長(zhǎng)為(42.5 ±3.7)mm，選取體質(zhì)健壯、反應(yīng)靈敏的個(gè)體用于試驗(yàn)，馴養(yǎng)7 d，試驗(yàn)前1 d 停止投喂。

LSB(100%分析純，購(gòu)自美國(guó)陶氏益農(nóng)公司)是一種脂溶性有機(jī)磷酸脂類(lèi)化合物，水溶性很低(＜2 mg/L)，但在溶媒二甲基亞砜(DMSO)中能夠迅速且完全溶解［10］，因此，筆者采用DMSO 助溶的方式配制體積分?jǐn)?shù)為0.01%的藥液。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)條件 試驗(yàn)在聚乙烯塑料箱(58 cm×35 cm×34 cm)中進(jìn)行，養(yǎng)殖用水為曝氣3 d 的凈化水。試驗(yàn)期間，每天采用便攜式多參數(shù)水質(zhì)分析儀(YSI-ADV6600)監(jiān)測(cè)水質(zhì)，pH 為6.5 ～7.5，總硬度(以CaCO3計(jì))為(10 ～250)mg/L，試驗(yàn)溫度為(20 ±2)℃，溶解氧(DO)≥7 mg/L，自然光照。為防止攝食的影響，試驗(yàn)期間不投喂餌料，馴養(yǎng)和試驗(yàn)期間蝦生長(zhǎng)正常。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 參照靜水生物測(cè)試法［18］，試驗(yàn)期間不更換試驗(yàn)液，根據(jù)環(huán)境中LSB 殘留的濃度范圍［14］，設(shè)定2、10、20、40、80 μg/L 5 個(gè)LSB質(zhì)量濃度梯度。每個(gè)濃度設(shè)2 個(gè)平行組，另設(shè)空白對(duì)照組和助溶劑DMSO 對(duì)照組，每組投放克氏原螯蝦20 只，試驗(yàn)過(guò)程中觀察蝦的行為和中毒癥狀。中毒后，經(jīng)多次刺激無(wú)反應(yīng)則判斷為死亡，將其撈出并記錄死亡數(shù)。

1.2.3 組織勻漿的制備及酶活性的測(cè)定 用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水漂洗樣品，再用濾紙吸去表面水分，按質(zhì)量與體積比為1∶ 10 加入上述生理鹽水，冰浴條件下，用超聲波進(jìn)行勻漿。勻漿液用冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5810R)以4 000 r/min 離心10 min，取上清液備用。

酶活性的測(cè)定方法及活性單位(U)定義參見(jiàn)文獻(xiàn)［19］。

1.2.4 指標(biāo)計(jì)算 采用半數(shù)致死濃度(LC50)來(lái)表征LSB 對(duì)克氏原螯蝦的毒性。采用寇氏(Karber)法［11］計(jì)算 24、48、96 h的LC50以 及l(fā)g(LC50)的95%置信限，并按下式計(jì)算安全濃度:

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 16.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析(Repeated Measures)和雙因素方差分析(Two - Way ANOVA)，用SigmaPlot 11.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LSB 對(duì)克氏原螯蝦的急性毒性

試驗(yàn)期間，空白對(duì)照組、DMSO 對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)蝦中毒或死亡，其他試驗(yàn)組在中毒初期，蝦急速爬動(dòng)，有些表現(xiàn)為腹部朝上，翻身困難，附肢抖動(dòng)，隨著中毒時(shí)間的延長(zhǎng)，動(dòng)作變得遲緩，逐步喪失運(yùn)動(dòng)能力，翻轉(zhuǎn)后附肢不停抽搐，最后躺臥箱底。

從圖1可見(jiàn):隨著LSB 質(zhì)量濃度的增加，其毒性作用不斷增強(qiáng)，蝦死亡率逐漸上升;隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，同一濃度組LSB 對(duì)克氏原螯蝦的毒性作用亦隨之增強(qiáng)。相同暴露時(shí)間內(nèi)，LSB 濃度越高，蝦死亡率越大;相同LSB 濃度條件下，染毒時(shí)間越長(zhǎng)，蝦死亡率越高。

圖1 LSB 質(zhì)量濃度和暴露時(shí)間對(duì)克氏原螯蝦死亡率的影響Fig.1 The effects of LSB concentration and exposure period on the mortality of the crayfish

以Karber 方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出24、48、96 h 的LC50分別為(28.24 ±2.81)、(19.52±2.03)、(13.13±1.71)μg/L，安全濃度為(2.79 ±0.31)μg/L，LC50隨著暴露時(shí)間(t)的延長(zhǎng)呈顯著下降趨勢(shì)，符合雙曲線衰減模型(圖2):

圖2 LC50隨試驗(yàn)時(shí)間變化的雙曲線衰減模型擬合Fig.2 The LC50 decreased with period and fitted with the hyperbolic decay model

2.2 LSB 對(duì)克氏原螯蝦肝胰臟抗氧化酶活性的影響

從圖3可見(jiàn):在染毒24 h和48 h 時(shí)，藥物對(duì)克氏原螯蝦肝胰臟SOD 活性的影響均不顯著(P ＞0.05);在染毒96 h 時(shí)，LSB 質(zhì)量濃度為20 μg/L的條件下，SOD 活性被誘導(dǎo)表達(dá)到最大值;之后隨藥物濃度的升高SOD 活性又下降。在時(shí)間和LSB 濃度的共同作用下，SOD 活性表現(xiàn)出顯著性差異(P=0.045＜0.05)(表1)。

表1 時(shí)間和LSB 濃度對(duì)克氏原螯蝦肝胰臟抗氧化酶活性的交互影響結(jié)果Tab.1 The two－way ANOVA on the interaction between exposure period and LSB concentration on parameters of the hepatopancreatic oxidative stress response

從圖3可見(jiàn):在低濃度(2 μg/L)染毒條件下，克氏原螯蝦肝胰臟CAT 活性隨時(shí)間的變化不大;當(dāng)LSB 的質(zhì)量濃度為10 μg/L 時(shí)，對(duì)CAT 活性具有激活作用，酶活性較對(duì)照組和低濃度組高，之后隨著藥物濃度的升高CAT 活性有下降趨勢(shì)。染毒48 h 時(shí)的CAT 活性變化與染毒24 h 時(shí)的變化趨勢(shì)相似，但其活性較24 h 低;染毒96 h 時(shí)，CAT 活性變化趨勢(shì)較大，在LSB 質(zhì)量濃度為20 μg/L 時(shí)，CAT 活性達(dá)到了最大值，之后隨藥物濃度的升高CAT 活性降低。CAT 活性隨時(shí)間和藥物濃度的變化呈極顯著性差異(P＜0.001)(表1)。

從圖3可見(jiàn):藥物濃度對(duì)肝胰臟GSH 含量的影響不大，在低濃度組染毒條件下其含量基本沒(méi)變化，當(dāng)LSB 質(zhì)量濃度達(dá)到20 ～80 μg/L 時(shí)，其24 h和48 h 時(shí)的GSH 含量有所下降，96 h 的GSH 含量則維持在較高水平。GSH 含量的變化在時(shí)間上出現(xiàn)了極顯著性差異(P＜0.001)(表1)。

圖3 時(shí)間、LSB 質(zhì)量濃度對(duì)克氏原螯蝦肝胰臟SOD、CAT、GSH 的影響Fig.3 The effects of exposure period and LSB concentration on the activities of SOD，and CAT，and GSH levels in the hepatopancreas of the crayfish

3 討論

3.1 控制LSB 對(duì)克氏原螯蝦毒性影響的措施

進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)對(duì)闡明受試動(dòng)物的毒性作用具有重要意義，是進(jìn)行藥物安全評(píng)價(jià)的重要手段。LSB 對(duì)新糠蝦Neomysis integer、隆線溞Daphnia carinata、南美白對(duì)蝦Penaeus vannmei、烏鱧Channa punctatus、羅非魚(yú)Oreochromis niloticus等的96 h LC50分 別 為 0.13、0.24、0.89、81.98、1.57 μg/L［4，9-14］，表明其對(duì)水生動(dòng)物均有極高毒性，即使攜帶極微量LSB 的稻田水流入養(yǎng)殖水體，也會(huì)對(duì)養(yǎng)殖品種產(chǎn)生嚴(yán)重危害。吳長(zhǎng)興等［8］對(duì)水稻1 個(gè)生產(chǎn)季節(jié)的LSB 使用情況及灌排水進(jìn)行了跟蹤調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在LSB 使用高峰期，排水對(duì)稻田周邊水域造成嚴(yán)重污染，出水中LSB 殘留量高達(dá)26.07 μg/L，遠(yuǎn)高于本試驗(yàn)中克氏原螯蝦(2.79 ±0.31)μg/L 的安全濃度。此外，2008年臺(tái)灣市場(chǎng)上23%的水產(chǎn)品檢測(cè)出LSB 殘留，通過(guò)對(duì)11 家水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)的所有環(huán)節(jié)進(jìn)行排查，發(fā)現(xiàn)在所投喂的飼料中存在高LSB 殘留［20］，每天投喂這些飼料使得農(nóng)藥在動(dòng)物體內(nèi)大量積累，并最終會(huì)通過(guò)食物鏈傳遞給人類(lèi)，因此，研究并控制LSB在養(yǎng)殖水體中的擴(kuò)散污染，對(duì)實(shí)現(xiàn)克氏原螯蝦等水產(chǎn)品的健康養(yǎng)殖及水產(chǎn)品質(zhì)量的安全保障具有重要意義。

水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)加強(qiáng)水源、器械及飼料等的管理，在養(yǎng)殖區(qū)域的田間應(yīng)盡量避免連續(xù)施用LSB，并提前做好預(yù)防工作，如在每年7—8月稻田L(fēng)SB使用的高峰期，可以采用微生物制劑對(duì)養(yǎng)殖水體中的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行凈化處理［21］。此外，加強(qiáng)光照、提高水溫與水體的pH，能夠有效地促進(jìn)LSB 的降解［5］。因此，養(yǎng)殖者應(yīng)加強(qiáng)清塘管理，降低池塘水位后可采用底泥暴曬與生石灰潑灑相結(jié)合的方式，促進(jìn)土壤及水體中LSB 的降解。

3.2 LSB 對(duì)克氏原螯蝦肝胰臟抗氧化系統(tǒng)的影響

本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦在20 μg/L 的LSB溶液中暴露96 h 時(shí)，肝胰臟SOD 活性被誘導(dǎo)表達(dá)到最大值;之后隨藥物濃度的升高SOD 活性又下降，與Beaumont等［17］的研究結(jié)果類(lèi)似，這種現(xiàn)象被稱(chēng)之為“毒物興奮效應(yīng)”［22］，當(dāng)機(jī)體受到重度逆境脅迫時(shí)，SOD 活性通常降低［23-24］。此外，由于在抗氧化系統(tǒng)中，CAT 與SOD 協(xié)同發(fā)揮作用［17］，因此變化趨勢(shì)較為相似，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，兩種酶活性均顯示先升后降的波動(dòng)趨勢(shì)。GSH 量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素，缺乏或耗竭GSH 會(huì)促使很多化學(xué)物質(zhì)或環(huán)境因素產(chǎn)生中毒作用或加重中毒作用［25］。本試驗(yàn)中，剛?cè)径镜?4 h，低濃度組(2 μg/L)克氏原螯蝦肝胰臟GSH 含量明顯降低，分析是由于此時(shí)機(jī)體消耗體內(nèi)GSH 來(lái)抵御LSB 引起蝦體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物及過(guò)氧化氫堆積的原因;隨著時(shí)間和藥物濃度的提高，GSH 含量有所升高，表明長(zhǎng)時(shí)間、高濃度的LSB對(duì)克氏原螯蝦的抗氧化系統(tǒng)造成了損傷，抑制了GSH 的消耗，表現(xiàn)為含量上升。本試驗(yàn)表明，SOD和CAT 活性及GSH 含量變化可以反映克氏原螯蝦受傷害的程度，并可用作克氏原螯蝦安全性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的參考依據(jù)。

此外，染毒時(shí)間越長(zhǎng)，機(jī)體受損傷程度越嚴(yán)重，如果毒物濃度過(guò)小，則可能對(duì)水生動(dòng)物組織不構(gòu)成損傷［26］。由此可見(jiàn)，染毒時(shí)間和藥物濃度均決定LSB 對(duì)克氏原螯蝦的毒性效果。此次試驗(yàn)中也觀察到低濃度組克氏原螯蝦很少死亡，因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)控制水體中LSB 的質(zhì)量濃度不高于(2.79 ±0.31)μg/L 這一安全濃度。

［1］黃羽，戴銀根，胡成鈺，等.克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及可持續(xù)發(fā)展對(duì)策［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(1):274 -277.

［2］徐增洪，周鑫，水燕.克氏原螯蝦的食物選擇性及其攝食節(jié)律［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27(2):166 -170.

［3］董學(xué)興，呂林蘭，黃金田，等.Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)對(duì)克氏原螯蝦代謝酶的影響［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，26(5):467 -470.

［4］祁力鈞，傅澤田，史巖.化學(xué)農(nóng)藥施用技術(shù)與糧食安全［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2002，18(6):203 -206.

［5］石利利，林玉鎖，徐亦鋼，等.毒死蜱農(nóng)藥環(huán)境行為研究［J］.土壤與環(huán)境，2000，9(1):73 -74.

［6］WHO.The WHO Recommended Classification of Pesticides by Hazard and Guidelines to Classification 2009［M］.Stuttgart，Germany:Wissenchaftliche Verlagsgesellschaft mbH，2009:24 -26.

［7］Pamela D W，Joseph R B.Tadpole size，cholinesterase activity，and swim speed in four frog species after exposure to sub-lethal concentrations of chlorpyrifos［J］.Aquatic Toxicology，2008，88(1):9-18.

［8］吳長(zhǎng)興，趙學(xué)平，吳聲敢，等.丘陵地區(qū)水稻田使用毒死蜱對(duì)水體的污染及其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)［J］.生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)，2011，27(3):108 -112.

［9］馬繼華，蔣耀培，劉泉，等.毒死蜱對(duì)南美白對(duì)蝦的急性毒性影響［J］.水產(chǎn)科技情報(bào)，2009，36(4):192 -194.

［10］David S，Nico M，Agna K，et al.Acute toxicity of pesticides to the tropical freshwater shrimp Caridina laevis［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety，2008，69(3):421 -427.

［11］Roast S D，Widdows J，Jones M B.Disruption of swimming in the hyperbenthic mysid Neomysis integer(Peracarida:Mysidacea)by the organophosphate pesticide chlorpyrifos［J］.Aquatic Toxicology，2000，47(4):227 -241.

［12］Mahmut S，Rabia S，F(xiàn)igen E.Effects of chlorpyrifos on reproductive performances of guppy(Poecilia reticulata)［J］.Chemosphere，2005，58(9):1293 -1299.

［13］Daoud A，Nagpurea N S，Sudhir K，et al.Genotoxicity assessment of acute exposure of chlorpyrifos to freshwater fish Channa punctatus(Bloch)using micronucleus assay and alkaline single-cell gel electrophoresis［J］.Chemosphere，2008，71(10):1823 -1831.

［14］Gül A.Investigation of acute toxicity of chlorpyrifos - methyl on Nile tilapia(Oreochromis niloticus L.)larvae［J］.Chemosphere，2005，59(2):163 -166.

［15］Filiz D，F(xiàn)atma G U，Dilek D，et al.Subacute chlorpyrifos - induced oxidative stress in rat erythrocytes and the protective effects of catechin and quercetin［J］.Pesticide Biochemistry and Physiology，2011，99:77 -81.

［16］侯方浩，余向陽(yáng)，趙于丁，等.毒死蜱對(duì)錦鯽性腺的影響及其在魚(yú)組織中的富集［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009:25(1):188 -191.

［17］Beaumont A R，Newman P B.Low levels of tributyhin reduce growth of marine microalgae［J］.Marine Pollution Bulletin，1986，17(10):457 -461.

［18］吳邦燦，費(fèi)龍.現(xiàn)代環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)［M］.北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，1999:252 -254.

［19］姚志峰，章龍珍，莊平，等.銅對(duì)中華鱘幼魚(yú)的急性毒性及對(duì)肝臟抗氧化酶活性的影響［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2010，17(4):731 -738.

［20］Sun F，Chen H S.Monitoring of pesticide chlorpyrifos residue in farmed fish:Investigation of possible sources［J］.Chemosphere，2008，71(10):1866 -1869.

［21］劉云煥，陳東海.微生物降解有機(jī)磷農(nóng)藥的研究進(jìn)展［J］.北方環(huán)境，2005，30(1):22 -24.

［22］Stebbing A R.Hormesis the stimulation of growth by low levels of inhibitions［J］.Science of the Total Environment，1982，22(1):213 -234.

［23］唐學(xué)璽，張培玉.蒽對(duì)黑鱈超氧化物歧化酶活性的影響［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2000，24(3):217 -220.

［24］Hegazi M M，Attia Z I，Ashour O A.Oxidative stress and antioxidant enzymes in liver and white muscle of Nile tilapia juveniles in chronic ammonia exposure［J］.Aquatic Toxicology，2010，99(2):118 -125.

［25］Palacea V P，Brown S B，Baron C I，et al.An evaluation of the relationships among oxidative stress，antioxidant vitamins and early mortality syndrome(EMS)of lake trout(Salvelinus namaycush)from Lake Ontario［J］.Aquatic Toxicology，1998，43:259 -268.

［26］汪開(kāi)毓，耿毅，葉仕根，等.鯉慢性喹乙醇中毒的病理學(xué)和組織學(xué)殘留［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2003，27(1):75 -82.