高鑫，閆喜武，張輝，張國范

(1.大連海洋大學 遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心，遼寧 大連116023;2.中國科學院 海洋研究所，山東 青島266071)

蛤仔Ruditapes philippinarum在中國的分布范圍南起香港、廣東(海門、汕尾、雷東、洲島)，北至河北(北戴河)、遼寧(莊河、長興島、海洋島)等地。目前，中國蛤仔年產量為320 萬t 左右，約占海水養(yǎng)殖產量的20%，約占貝類產量的30%，占世界蛤仔總產量的90%以上。缺少高產抗逆品種成為蛤仔養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的“瓶頸”。為了改變這種狀況以實現(xiàn)蛤仔產業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展，開展蛤仔系統(tǒng)的育種工作研究是非常必要的。目前，蛤仔高產抗逆品種培育方面的遺傳育種工作已取得一定的進展［1-3］。

雜交作為生物育種的重要方法之一，已在水產生物的品種改良中發(fā)揮著重大作用［4］。由于雜種優(yōu)勢的存在，雜交有可能迅速和顯著地提高水產生物的產量或生活力［5］。有關貝類的雜交育種研究，國內外已有許多報道。大多數(shù)種間雜交由于授精時配子間不親和以及胚胎發(fā)育障礙等問題，未能得到生產應用或只能作為育種的中間材料。然而，貝類亞種間、不同地理群體間的雜交在長牡蠣［6］、海灣扇貝［7-8］、櫛孔扇貝［9］、貽貝［10］、馬氏珠母貝［11］、雜色鮑［12］等貝類上已取得了可喜的進展，大多都能獲得正的雜種優(yōu)勢。張躍環(huán)等［2，13］對不同地理群體菲律賓蛤仔的生長發(fā)育進行了比較，閆喜武等［1］對蛤仔不同殼色品系間的雙列雜交進行了研究，丁鑒峰等［14］對不同殼色品系蛤仔的免疫機能進行了比較。但有關蛤仔不同地理群體間雜交方面的研究目前尚未見報道。為此，作者研究了蛤仔南北方地理群體間的雜交效應，旨在為蛤仔的雜交育種以及雜種優(yōu)勢在生產中的利用提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 親貝來源

蛤仔親貝來自于南北方兩個不同地理群體，北方大連養(yǎng)殖群體是用北方野生個體經人工繁殖培育的3 齡蛤仔;南方莆田養(yǎng)殖群體是用南方野生個體經人工繁殖培育的3 齡蛤仔。于2010年6月，在莊河海洋貝類養(yǎng)殖場室外生態(tài)池進行親貝促熟。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 于2010年10月選取性腺成熟的蛤仔北方群體(N)與南方群體(S)各500枚進行雙列雜交。采用陰干流水刺激法對親貝進行催產，分別收集4 組親本N♀、N♂、S♀、S♂各30個個體的精子或卵子，將收集好的精、卵分別進行人工授精，采用雙列雜交法建立自交組和雜交組，即雜交組為N♀×S♂和S♀×N♂，自交組為N♀×N♂和S♀×S♂，得到4 個試驗組的F1代，每組設3 個重復。

1.2.2 子代培育 按照閆喜武等［15-16］培養(yǎng)其他灘涂貝類的方法，在50 L 塑料桶中培育子代幼蟲和稚貝。以等鞭金藻Isochrysis galbana和小球藻Chlorella vulgaris 為主要餌料，連續(xù)充氣，每兩天全量換水一次。幼蟲培育密度為8 ～10 個/mL，稚貝培育密度為2 ～4 個/mL。60 d 后將稚貝收集到60 目網袋中在室內水泥池中吊養(yǎng)。

1.2.3 指標測定 幼蟲和殼長小于3.0 mm 的稚貝，使用顯微鏡目微尺測量大小;殼長大于3.0 mm 的稚貝，使用游標卡尺測量大小。每次測量設3 個重復，每個重復隨機測量30 個個體。幼蟲存活率為單位體積存活的幼蟲數(shù)占最初孵化出D 形幼蟲數(shù)的百分比;稚貝存活率為不同日齡存活稚貝的數(shù)量占變態(tài)稚貝數(shù)量的百分比。

1.2.4 雜種優(yōu)勢的計算 按照Cruz等［17］的方法，雜種優(yōu)勢的計算公式為

式中:H表示雙親雜種優(yōu)勢;HNS、HSN表示雙列雜交中正、反交組的單親雜種優(yōu)勢;NN、NS、SN、SS 分別表示4 個試驗組的F1在同一日齡時的表型值(生長、存活)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用平均值± 標準差表示，用SPSS 17.0 進行單因素方差分析，用Duncan 法進行多重比較。差異顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 幼蟲的生長、存活及雜種優(yōu)勢

2.1.1 生長和雜種優(yōu)勢 NN、NS、SN、SS 組幼蟲在3、6、9日齡的平均殼長、生長速度和雜種優(yōu)勢見表1。從表1可見:3日齡時，NN 組和SN 組幼蟲的平均殼長明顯大于NS 組和SS 組(P＜0.05);6日齡時，4 個試驗組間幼蟲的平均殼長均有顯著性差異(P＜0.05)，大小順序為SN ＞NN＞SS ＞NS;9日齡時，SN 組和SS 組幼蟲的平均殼長最大，且兩組間無顯著性差異(P ＞0.05)，但均與NN 組有顯著性差異(P＜0.05)，與NS 組無顯著性差異(P ＞0.05)。從生長速度上看，NS 組幼蟲具有生長優(yōu)勢，其殼長生長雜種優(yōu)勢平均值為11.23%;與此相反，SN 組表現(xiàn)出生長劣勢，其殼長生長雜種優(yōu)勢平均值為-6.05%;總體上，雜交組較自交組(2.12%)具有生長優(yōu)勢。

表1 試驗組各日齡幼蟲的平均殼長和雜種優(yōu)勢Tab.1 The average shell length and growth heterosis in various day old larvae for each experimental group

2.1.2 存活率和雜種優(yōu)勢 NN、NS、SN、SS 組幼蟲在3、6、9日齡的平均存活率及存活優(yōu)勢見表2。從表2可見:3日齡時，SN 組幼蟲的存活率最低(51.66%)，明顯小于NN 組和NS 組(P＜0.05)，NN 組幼蟲的存活率最高(71.33%)，明顯大于SN 組和SS 組(P＜0.05);6日齡時，4 個試驗組幼蟲的存活率均有顯著性差異(P＜0.05)，且從大到小依次為NN ＞NS ＞SS ＞SN;9日齡時，NN 組和NS 組幼蟲的存活率明顯大于SN 組和SS組(P＜0.05)，SS 組幼蟲的存活率明顯大于SN組(P＜0.05)。從存活優(yōu)勢上看，9日齡時NS、SN 組未表現(xiàn)出雜種存活優(yōu)勢。但總體而言，NN 組和NS 組幼蟲的存活率大于SN 組和SS 組。

表2 各試驗組幼蟲的存活率和雜種優(yōu)勢Tab.2 Larval survival rate and survival heterosis for each experimental group

在幼蟲階段，NS 組和SN 組的生長和存活優(yōu)勢表現(xiàn)出明顯的正負不對稱性。

2.2 稚貝的生長、存活及雜種優(yōu)勢

2.2.1 生長和雜種優(yōu)勢 各試驗組稚貝的平均殼長、生長速度以及雜種優(yōu)勢見表3。從表3可見:30日齡時，NN 組和NS 組稚貝的平均殼長大于SN 組和SS 組(P＜0.05);60日齡時，4 個組稚貝的平均殼長均有顯著性差異(P＜0.05)，從大到小依次為NN ＞NS ＞SN ＞SS;90日齡時，NS 組稚貝的平均殼長明顯大于其他3 組(P＜0.05)，SN 組稚貝的殼長明顯大于NN 組和SS 組(P＜0.05)，NN 組和SS 組無顯著性差異(P ＞0.05)。從生長速度上看，NS 組和SN 組均表現(xiàn)出生長優(yōu)勢，其殼長生長雜種優(yōu)勢平均值分別為24.89%、15.12%，自交組殼長生長雜種優(yōu)勢平均值為19.93%。

2.2.2 存活率和雜種優(yōu)勢 各試驗組稚貝的存活率及存活優(yōu)勢見表4。從表4可見:30日齡時，NN 組和NS 組稚貝存活率明顯高于SN 組和SS 組(P＜0.05);60、90日齡時，NS 組稚貝存活率均明顯高于其他3 組(P＜0.05)，NN 組稚貝存活率也明顯高于SN 組和SS 組(P＜0.05)，而SN 組和SS 組無顯著性差異(P ＞0.05)。從存活優(yōu)勢上看，90日齡時NS 組稚貝表現(xiàn)出單親存活優(yōu)勢，其雜種優(yōu)勢平均值為5.72%，SN 組也表現(xiàn)出微弱的單親存活優(yōu)勢，其雜種優(yōu)勢平均值為0.24%。總體來看，雜交組較自交組(3.04%)具有存活優(yōu)勢。

在稚貝階段，NS 組和SN 組的生長速度和存活率雖然較NN 組和SS 組具有雜種優(yōu)勢，但雜種優(yōu)勢平均值的大小表現(xiàn)出明顯的不對稱性。

表3 各試驗組稚貝的平均殼長和雜種優(yōu)勢Tab.3 The average shell length and growth heterosis in the juvenile Manila clam for each experimental group

表4 各試驗組稚貝的存活率和雜種優(yōu)勢Tab.4 The survival rate and survival heterosis in juvenile clam for each experimental group

3 討論

雜交是動植物育種的重要方法之一。貝類雜交育種研究在長牡蠣［6］、皺紋盤鮑［18］和櫛孔扇貝［19］中開展得較多。相比之下，有關蛤仔雜交的研究較少，起步也較晚，且主要集中在蛤仔不同殼色品系和不同殼型的雜交上，尚未見關于不同地理群體間雜交的報道。蛤仔是世界性分布的雙殼貝類，由于長期的地理隔離，造成基因型的分化，形成了不同的地理群體。閆喜武等［20］對蛤仔莆田群體與大連群體的生物學進行了比較，發(fā)現(xiàn)兩個蛤仔群體在殼型、生物學零度、繁殖期、產卵量、卵徑、D 型幼蟲大小、變態(tài)時間、生長速度等方面均存在明顯差異。本研究結果顯示:無論是在幼蟲期、稚貝期還是在養(yǎng)成階段，S 群體自交組殼長均小于N 群體自交組，造成這種差異的根本原因是兩群體在遺傳上的差異;正交組NS 的生長性狀在幼蟲期和稚貝期獲得顯著雜種優(yōu)勢，反交組SN 的生長性狀在稚貝期獲得顯著生長優(yōu)勢。本研究中，自交組和雜交組的受精率都很高，在胚胎發(fā)育時間上也基本一致，證明了蛤仔南北方群體雜交并不存在授精時配子間不親和以及胚胎發(fā)育障礙等問題。

按照性狀表現(xiàn)類型，雜種優(yōu)勢表現(xiàn)為存活優(yōu)勢與生長優(yōu)勢;按照親本類型，雜種優(yōu)勢表現(xiàn)為雙親雜種優(yōu)勢與單親雜種優(yōu)勢。本研究結果與鄭懷平等［7］對海灣扇貝和閆喜武等［21］對蛤仔的同類研究結果相似。雜種優(yōu)勢具有明顯的正負不對稱性或大小不對稱性，這種不對稱現(xiàn)象在雜交育種中是廣泛存在的。本試驗中，正交組合NS 獲得的雜種優(yōu)勢比反交組合SN 大(稚貝期尤為明顯)，筆者認為，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是多方面的。首先，有研究表明，貝類群體雜合度與其生長和適合度呈正相關［22］。本試驗中，蛤仔N 群體來自于大連石河鎮(zhèn)，由于經過很多代群體內自繁，基因多樣性較差，與S 群體相比，N 群體的雜合度低，雜交使其雜合度得到了更大的提高，因此，N 群體獲得了更好的雜交改良效果。其次，由于本試驗在北方進行，試驗水溫比南方同期海水溫度低，與S 群體相比，N 群體更為適應較低的水溫條件。這可能是造成正交組合NS 比反交組合SN 生長速度快的原因之一。

［1］閆喜武，張躍環(huán)，霍忠明，等.不同殼色菲律賓蛤仔品系間的雙列雜交［J］.水產學報，2008，32(6):864 -875.

［2］張躍環(huán)，閆喜武，霍忠明，等.不同地理群體菲律賓蛤仔生長發(fā)育的比較［J］.大連水產學院學報，2009，24(1):34 -39.

［3］閆喜武.菲律賓蛤仔養(yǎng)殖生物學、養(yǎng)殖技術和品種選育［D］.青島:中國科學院海洋研究所，2005.

［4］吳仲慶.水產生物遺傳育種學［M］.3 版.廈門:廈門大學出版社，2000.

［5］樓允東.魚類育種學［M］.北京:中國農業(yè)出版社，1999.

［6］孔靜，王昭萍，劉劍，等.長牡蠣中國群體和美國群體雜交效應與三倍體的優(yōu)勢［J］.水產學報，2011，35(5):676 -681.

［7］鄭懷平，張國范，劉曉，等.海灣扇貝雜交家系與自交家系生長和存活的比較［J］.水產學報，2004，28(3):267 -272.

［8］Wang Chunde，Li Zhaoxia.Improvement in production traits by mass spawning type crossbreeding in bay scallops［J］.Aquaculture，2010，299:51 -56.

［9］劉小林，常亞青，相建海，等.櫛孔扇貝不同種群雜交效果的初步研究［J］.海洋學報，2003，25(1):93 -99.

［10］Miguel A，Rio-Portilla D，Andy R B.Larval growth，juvenile size and heterozygosity in laboratory reared mussels，Mytilus edulis［J］.J Exp Marine Biol Ecol，2000，254:1 -17.

［11］王愛民，閻冰，葉力，等.馬氏珠母貝不同地理種群內自繁和種群間雜交子一代主要性狀的比較［J］.水產學報，2003，27(3):201 -206.

［12］游偉偉，柯才煥，蔡明夷，等.雜色鮑日本群體與臺灣群體雜交的初步研究［J］.廈門大學學報:自然科學版，2005，44(5):701 -705.

［13］張躍環(huán)，閆喜武，姚托，等.菲律賓蛤仔2 個殼色品系群體雜交的研究［J］.南方水產，2008，4(3):27 -32.

［14］丁鑒鋒，楊霏，閆喜武，等.不同殼色菲律賓蛤仔免疫機能的比較研究［J］.大連海洋大學學報，2012，27(5):411 -416.

［15］閆喜武，趙生旭，張澎，等.培育密度及餌料種類對大竹蟶幼蟲生長、存活及變態(tài)的影響［J］.大連海洋大學學報，2010，25(5):386 -391.

［16］閆喜武，王琦，趙越，等.中國蛤蜊人工育苗技術的初步研究［J］.大連海洋大學學報，2010，25(1):41 -44.

［17］Cruz P，Ibarra A M.Larval growth and survival of two catarina scallop(Argopecten circularis，Sowerby，1835)populations and their reciprocal crosses［J］.Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，1997，212:95 -110.

［18］張國范，王繼紅，趙洪恩，等.皺紋盤鮑中國群體和日本群體的自交與雜交F1的RAPD 標記［J］.海洋與湖沼，2002，33(5):484 -491.

［19］李紅蕾，宋林生，劉保忠，等.櫛孔扇貝不同種群的遺傳結構及其雜種優(yōu)勢［J］.海洋與湖沼，2002，33(2):188 -195.

［20］閆喜武，張國范，楊鳳，等.菲律賓蛤仔莆田群體與大連群體生物學比較［J］.生態(tài)學報，2005，25(12):3329 -3334.

［21］閆喜武，張躍環(huán)，孫煥強，等.菲律賓蛤仔兩道紅與白斑馬品系的三元雜交［J］.水產學報，2010，34(8):1190 -1197.

［22］English L J，Maguire G B，Ward R D.Genetic variation of wild and hatchery populations of the Pacific oyster，Crassostrea gigas(Thunberg)，in Australia［J］.Aquaculture，2000，187:283 -298.