李建林，唐永凱，李紅霞，俞菊華，董在杰

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 淡水漁業(yè)研究中心農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214081)

建鯉Cyprinus carpio var.jian是以荷包紅鯉和元江鯉為親本，通過家系選育、多系雜交、雌核發(fā)育和橫交固定等育種技術(shù)相結(jié)合而培育成的魚類新品種［1］。該品種具有生長快、肉質(zhì)好、抗逆性強(qiáng)、易起捕等經(jīng)濟(jì)性狀［2］，雖然建鯉遺傳性狀比較穩(wěn)定，但要保持或更進(jìn)一步提高其經(jīng)濟(jì)性狀，仍需要對建鯉不斷地進(jìn)行選育保種和遺傳保護(hù)。

分子標(biāo)記直接反映的是親本間基因組水平上的遺傳差異，能夠在一定程度上預(yù)測后代優(yōu)勢的產(chǎn)生。目前對鯉功能基因組學(xué)及其遺傳連鎖圖譜的研究較為深入［3］，分子標(biāo)記輔助選育技術(shù)也已逐步應(yīng)用于鯉育種中。微衛(wèi)星標(biāo)記具有多態(tài)性頻率高、共顯性的孟德爾式遺傳等優(yōu)點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)家系間和個(gè)體間的遺傳差異、親緣關(guān)系分析等較為理想的分子標(biāo)記［4］，如在大菱鲆［5］、真鯛［6］、大西洋比目魚［7］、牙鲆［8］、虹鱒［9］、馬氏珠母貝［10］等水產(chǎn)生物中都有相關(guān)報(bào)道。為進(jìn)一步提高建鯉的生長速度和遺傳穩(wěn)定性，2011年本課題組運(yùn)用與建鯉生長相關(guān)的SNP 標(biāo)記［11］構(gòu)建了30 個(gè)家系進(jìn)行了育種試驗(yàn)，本研究中，作者采用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)分析了其中6 個(gè)家系的遺傳結(jié)構(gòu)及不同親緣關(guān)系個(gè)體間的遺傳差異，旨在為應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記輔助構(gòu)建建鯉家系和保種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)魚取自于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興養(yǎng)殖基地，從30 個(gè)建鯉家系中隨機(jī)取6 個(gè)家系，編號為3#、5#、7#、8#、9#、10#。剪取各家系親本以及各家系子代共30 尾個(gè)體的鰭條，用體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 的提取 樣本鰭條經(jīng)蛋白酶K 消化后，用保和酚、氯仿抽提總DNA［12］，用瓊脂糖凝膠電泳測定DNA 基因組的完整性，再用紫外分光光度計(jì)測定DNA 樣品的濃度和純度，稀釋DNA 至50 ～100 ng/μL，于4 ℃下保存?zhèn)溆?。從每個(gè)家系中隨機(jī)取12 尾子代及其親本的DNA 樣品用于試驗(yàn)分析。

1.2.2 引物合成及PCR 反應(yīng) 微衛(wèi)星引物為中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所開發(fā)的鏡鯉微衛(wèi)星標(biāo)記引物［13-14］，由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。表1 列出了經(jīng)篩選得到的12 對在建鯉中能擴(kuò)增出清晰條帶的引物序列和退火溫度。PCR 反應(yīng)總體積為10 μL，其中含10×buffer 1.0 μL，2 mmol/L MgCl21.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL，10 μmol/L 引物0.1 μL，5 U/μL Taq 酶0.1 μL，50 ～100 ng/μL DNA 1.0 μL。PCR 反應(yīng)條件為:94℃下預(yù)變性3 min;94 ℃下變性20 s，退火20 s，72 ℃下延伸20 s，共進(jìn)行30 個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下延伸8 min，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 電泳及染色 PCR 產(chǎn)物用8.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。電泳結(jié)束后，用硝酸銀染色后拍照記錄電泳結(jié)果。根據(jù)25 bp DNA Step Ladder(Promega)分子量標(biāo)記和PCR 擴(kuò)增片段大小，分析各位點(diǎn)的等位基因，并確定基因型。

表1 12 對微衛(wèi)星引物序列及其反應(yīng)條件Tab.1 The sequences and PCR reaction conditions of 12 primer pairs

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)每個(gè)個(gè)體的PCR 擴(kuò)增條帶建立基因型數(shù)據(jù)矩陣，用Cervus 3.0和GenAlEx 6.2 軟件分析每一位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)和遺傳分化系數(shù)(Fst)等參數(shù);用Populations 軟件計(jì)算群體和個(gè)體間的DA遺傳距離［15］;使用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件對不同親緣關(guān)系個(gè)體間的遺傳距離進(jìn)行單因素方差分析;根據(jù)遺傳距離用Mgea 5.1 軟件按非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPGMA)對不同家系建立聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 12 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性

本試驗(yàn)中所選出的12 對微衛(wèi)星引物在建鯉群體中均能擴(kuò)增出清晰的條帶，并且重復(fù)性好，PCR產(chǎn)物通過8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳可以清楚地分辨基因型，圖1 為位點(diǎn)HLJ1316(a)、HLJ1410(b)和HLJ1458(c)的部分電泳結(jié)果。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，各位點(diǎn)在6 個(gè)建鯉家系中共檢測出80 個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)檢測到的等位基因?yàn)? ～10 個(gè)，平均為6.7 個(gè);共檢測出基因型172種，每個(gè)位點(diǎn)檢測到的基因型為5 ～24種，平均為14.3種。12 個(gè)位點(diǎn)中HLJ1458 的多態(tài)性最高，檢測到10 個(gè)等位基因和24種基因型。

2.2 6 個(gè)家系的遺傳多樣性及遺傳分化

2.2.1 遺傳多樣性 12 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，只有位點(diǎn)HLJ1211在5#家系以及位點(diǎn)HLJ1410在10#家系表現(xiàn)為單態(tài)性，其他均為多態(tài)性。從表2可見:12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分別在6 個(gè)建鯉家系中平均檢測到等位基 因 2.9 ～3.3 個(gè);平 均 Ho和He 分 別為0.725 ～0.883和0.533 ～0.656;平均PIC 為0.440 ～0.584;3#家系各遺傳多樣性參數(shù)均為最高;6 個(gè)建鯉家系平均固定系數(shù)(FIS)為-0.422～-0.318，都表現(xiàn)為雜合子過剩(FIS＜0)。

2.2.2 家系間的遺傳分化 從表3可見:各家系間的遺傳距離為0.312 9 ～0.578 9，平均為0.458 7，3#家系與10#家系間的遺傳距離最小，5#家系與8#家系間的遺傳距離最大。UPGMA 聚類分析結(jié)果表明(圖2)，3#家系與10#家系以及8#與9#家系親緣關(guān)系比較近，聚類在同一小分支上，其他家系親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。AMOVA 分析結(jié)果表明，6 個(gè)家系的Fst為0.115 ～0.390，平均 為0.209 4，說明有21%的遺傳變異來源于家系間，79%來源于家系內(nèi)。6 個(gè)建鯉家系中，12 個(gè)位點(diǎn)的基因流(Nm)為0.368 ～1.404，平均為0.962 3，其中5 個(gè)位點(diǎn)的Nm大于1，7 個(gè)位點(diǎn)的Nm小于1。

圖1 位點(diǎn)HLJ1316(a)、HLJ1410(b)、HLJ1458(c)的部分?jǐn)U增結(jié)果Fig.1 Partial results amplified by HLJ1316(a)，HLJ1410(b)and HLJ1458(c)

表2 12 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在6 個(gè)建鯉家系中的平均遺傳信息Tab.2 Average genetic information of the 12 microsatellite loci in 6 common carp Cyprinus carpio var.jian families

圖2 6 個(gè)建鯉家系UPGMA 聚類分析結(jié)果Fig.2 UPGMA dendrogram among 6 common carp Cyprinus carpio var.jian families

表3 6 個(gè)建鯉家系間的遺傳距離Tab.3 Genetic distance of 6 common carp C.carpio var.jian families

2.3 不同親緣關(guān)系個(gè)體間的遺傳差異

經(jīng)Populations 軟件計(jì)算得到84×84 所有個(gè)體間的遺傳距離矩陣，在不分家系的情況下，個(gè)體間的遺傳距離為0.108 ～0.875，平均為0.587 2;按不同親緣關(guān)系進(jìn)行分析結(jié)果表明:父本與子代的遺傳距離為0.257 0 ～0.448 2，平均為0.333 1;母本與子代的遺傳距離為0.240 ～0.507，平均為0.347 7;同胞子代間的遺傳距離為0.108 ～0.591，平均為0.318 0;不同家系沒有血緣關(guān)系個(gè)體間的遺傳距離為0.358 ～0.875，平均為0.635 3。父子間、母子間和同胞子代間的遺傳距離相近，但無顯著性差異(P＞0.05)，不同家系沒有血緣關(guān)系個(gè)體間的遺傳距離要大于親子間和同胞子代間的遺傳距離，且差異極顯著(P＜0.01)。表4 列出了各家系不同親緣關(guān)系個(gè)體間的平均遺傳距離。

表4 不同親緣關(guān)系個(gè)體間的平均遺傳距離Tab.4 Average genetic distance between the individuals with different genetic relationship

3 討論

3.1 6 個(gè)建鯉家系的遺傳多樣性

通過對不同家系的遺傳多樣性分析，可了解各家系的遺傳潛力和選育空間。本試驗(yàn)中所篩選到的12 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在6 個(gè)建鯉家系中平均檢測到6.7個(gè)等位基因和14.3種基因型，具有較高的多態(tài)性，能很好地用于建鯉群體的遺傳多樣性評估。雜合度和多態(tài)信息含量都是度量種群遺傳多樣性程度的重要參數(shù)，其含量越大群體遺傳結(jié)構(gòu)變異越大，對環(huán)境適應(yīng)能力就越強(qiáng)［16］。Dewoody等［17］利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析得出13種淡水魚類的平均Ho 為0.46。本試驗(yàn)中建鯉各家系的平均Ho 為0.725 ～0.883，說明這6 個(gè)建鯉家系的遺傳變異水平較高，有較強(qiáng)的適應(yīng)力;12 個(gè)位點(diǎn)在各家系中的平均PIC 為0.440 ～0.584，根據(jù)Botstein等［18］提出的衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標(biāo)，12 個(gè)位點(diǎn)在5#、7#、8#家系中表現(xiàn)為高度多態(tài)(PIC ＞0.50)，在3#、9#和10#家系中表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.25＜PIC＜0.50)，但接近于高度多態(tài)。群體內(nèi)FIS 反映了觀察雜合度和期望雜合度之間的平衡關(guān)系，F(xiàn)IS 值越接近零，基因型的分布就越接近平衡狀態(tài)。當(dāng)FIS ＞0 時(shí)，表明雜合子缺失;當(dāng)FIS＜0時(shí)，表明雜合子過剩［19］。本試驗(yàn)中6 個(gè)建鯉家系FIS 都小于零，表明這6 個(gè)建鯉群體存在雜合子過?，F(xiàn)象。綜合各遺傳參數(shù)，6 個(gè)建鯉家系遺傳多樣性較為豐富，具有較大的遺傳潛力和選育空間。

3.2 6 個(gè)建鯉家系間的遺傳差異和分化

聚類分析結(jié)果可以明顯地表現(xiàn)群體間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近［20］，本試驗(yàn)中聚類結(jié)果表明，3#家系與10#家系間以及8#家系與9#家系間遺傳距離較小，親緣關(guān)系比較近;5#家系與8#家系間遺傳距離較大，親緣關(guān)系相對比較遠(yuǎn)。本試驗(yàn)中得到的不同家系遺傳距離和聚類關(guān)系樹可為今后建鯉家系的選留、構(gòu)建新家系等提供參考。Fst是衡量群體間遺傳分化的重要指標(biāo)，當(dāng)0＜Fst＜0.05 時(shí)，表明群體遺傳分化較弱;當(dāng)0.05＜Fst＜0.15 時(shí)，為中度分化;當(dāng)0.15＜Fst＜0.25 時(shí)，為分化較大;當(dāng)Fst＞0.25 時(shí)，表明群體遺傳分化很大［18］。本試驗(yàn)中AMOVA 結(jié)果表明，12 個(gè)位點(diǎn)的Fst值平均為0.209 4，即有21%的遺傳變異來源于家系間，79%來源于家系內(nèi)的個(gè)體間，說明家系間有較大的遺傳分化。Nm則是抵抗群體分化、維持群體遺傳均質(zhì)化的力量，如果群體間Nm＞1，基因流則能發(fā)揮均質(zhì)化作用，能有效防止不同群體間產(chǎn)生遺傳分化;反之，如果群體間Nm＜1，則表明各群體間基因流受阻，群體可能走向遺傳分化［21］。本試驗(yàn)中平均Nm為0.962 3，說明6 個(gè)建鯉家系基因交流程度偏低，可能會(huì)導(dǎo)致家系遺傳分化，可擴(kuò)大建鯉的選育空間。

3.3 6 個(gè)建鯉家系個(gè)體間的遺傳差異

本試驗(yàn)中檢測了所有個(gè)體間的遺傳距離，并按父子間、母子間、同胞間和不同家系沒有血緣關(guān)系個(gè)體間4種遺傳關(guān)系進(jìn)行了分析，提供了這幾種不同親緣關(guān)系建鯉個(gè)體間的遺傳距離范圍。試驗(yàn)結(jié)果表明，父本、母本與子代間的平均遺傳距離分別為0.333 1和0.347 7，同胞子代間的平均遺傳距離為0.318 0，三者沒有顯著差異，說明親子之間的遺傳距離與同胞子代之間遺傳距離范圍相近。不同家系沒有血緣關(guān)系個(gè)體間的平均遺傳距離為0.635 3，要顯著大于親子之間和同胞子代之間的遺傳距離，說明沒有血緣關(guān)系個(gè)體間的遺傳距離與親子間、同胞子代間的遺傳距離有一定的范圍差距。由此，當(dāng)檢測不明遺傳背景的建鯉個(gè)體時(shí)，通過計(jì)算遺傳距離，再根據(jù)不同親緣關(guān)系個(gè)體間的遺傳距離范圍，可以大致推斷出它們的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。家系選擇是重要的傳統(tǒng)選育手段，家系選育的成功很大程度上取決于家系的構(gòu)建，即親本的選擇配組。Melchinger等［22］認(rèn)為，遺傳距離與雜種優(yōu)勢呈顯著正相關(guān)，親本的遺傳距離越遠(yuǎn)，則交配產(chǎn)生雜種優(yōu)勢就越明顯，通過檢測所有個(gè)體間的遺傳距離，可在今后構(gòu)建建鯉家系時(shí)指導(dǎo)親本的選擇和配組，這對加強(qiáng)建鯉的種質(zhì)遺傳改良和培育新品系具有重要意義。

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