郝君,楊薔,鮑迪,梁愛軍,張興華,董仕

(天津師范大學生命科學學院天津市動植物抗性重點實驗室,天津300387)

6種魚mtDNA D-loop及其鄰近區(qū)段的序列比較分析

郝君,楊薔,鮑迪,梁愛軍,張興華,董仕

(天津師范大學生命科學學院天津市動植物抗性重點實驗室,天津300387)

采用PCR技術對烏克蘭鱗鯉Cyprinus carpio、鯽Carassis auratus、鰱Hypophthalmichthys molitrix、鳙Aristichthys nobilis、草魚Ctenopharyngodon idellus和烏蘇里擬鲿Pseudobagrus ussuriensis共28個個體(分屬于天津市動植物抗性重點實驗室應用PCR-RFLP方法已檢測出的不同單倍型)的mtDNA D-loop及其鄰近區(qū)段進行擴增并測序,獲得了大小為1 500～1 800 bp的擴增產物。用Clustal 1.83軟件與GenBank中的鯉、金魚、鰱、草魚、長吻鮠5種魚的mtDNA全序列進行排序比較,確定擴增產物包含完整的tRNAPro、D-loop、tRNAPhe序列以及12S rRNA長度約為400 bp的部分序列。將6種魚共28個樣本的序列提交GenBank后獲得序列號為KC292921～KC292948。運用Mega 4.0軟件計算出6種魚的堿基組成和堿基差異,基于Kimura雙參數模型計算種間的遺傳距離,并與GenBank中5種魚的mtDNA序列一起構建NJ系統(tǒng)樹。序列結構分析表明,在6種魚序列的4個區(qū)段中,D-loop區(qū)段在種內、種間的差異性均高于另外3個區(qū)段。6種魚NJ系統(tǒng)樹的結果與傳統(tǒng)分類方法一致,可為魚類分類以及種類鑒定提供科學依據。另外,6種魚各種單倍型均在所測得序列中找到相應的酶切位點,印證了RFLP實驗結果,在酶切位點以外也發(fā)現了同種魚的不同單倍型間存在堿基差異。

烏克蘭鱗鯉;鯽;鰱;鳙;草魚;烏蘇里擬鲿;D-loop;NJ系統(tǒng)樹

魚類線粒體DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)是一種環(huán)狀共價閉合的雙鏈超螺旋分子,為核外遺傳物質。具有嚴格的母系遺傳、結構簡單、分子量小、無組織特異性和進化速率快等特點,被廣泛應用于物種起源、遺傳分化、種內種間系統(tǒng)發(fā)生關系及原種鑒定等方面[1-9]。

D-loop區(qū)是mtDNA上最重要的非編碼區(qū),受進化壓力小,變異程度高,進化速率是mtDNA其他區(qū)段的2～5倍。D-loop區(qū)位于 tRNAPro和 tRNAPhe之間,包含與DNA復制和轉錄相關的序列,是分析相近物種種間和種內遺傳多樣性的有效分子遺傳標記,也是近年來 mtDNA 的研究熱點[6-7,10-12]。在測序技術未被廣泛應用于mtDNA研究之前,對魚類的種群結構、物種多樣性方面的研究大多基于RFLP分析[13-14]。隨著PCR技術以及自動化測序技術的發(fā)展,已有許多研究人員將D-loop區(qū)作為分子標記應用于魚類遺傳分化的研究[1-7]。

鯉Cyprinus carpio與鯽Carassis auratus是中國最重要的淡水養(yǎng)殖魚類,在世界范圍內廣泛養(yǎng)殖,歷史悠久,并形成許多亞種和品系,鯉品種之一的烏克蘭鱗鯉的養(yǎng)殖已產生了巨大的經濟效益[15];鰱Hypophthalmichthys molitrix、鳙Aristichthys nobilis和草魚Ctenopharyngodon idellus是中國特產魚類,與青魚 Mylopharyngodon piceus一起被譽為中國“四大家魚”,是世界水產養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要養(yǎng)殖種類[16-19];烏蘇里擬鲿 Pseudobagrus ussuriensis主要分布于中國黑龍江水系,其營養(yǎng)豐富,肉質鮮美,具有很高的經濟價值[20-21]。本研究中,作者選用天津市動植物抗性重點實驗室進行過mtDNA D-loop區(qū)PCR-RFLP分析的6種魚的部分個體為試驗材料,對其D-loop及其鄰近區(qū)段進行PCR擴增和序列測定,對測序結果進行種內、種間遺傳結構差異分析,構建系統(tǒng)樹,探討D-loop及其鄰近區(qū)段作為分子標記對系統(tǒng)分化研究的意義。同時對6種魚PCR擴增區(qū)段的序列結構與PCR-RFLP檢測結果進行比較,旨在為魚類分類以及種類鑒定提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用烏克蘭鱗鯉2尾(每種單倍型各1尾)[15],鯽3尾(采自子牙河天津段)[22],鰱12尾(每種單倍型各1尾)[23],鳙7尾(每種單倍型各1尾)[24],草魚2尾(每種單倍型各1尾)[25],烏蘇里擬鲿2尾(采自天津市天祥水產養(yǎng)殖場)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 從每尾鮮活試驗魚體上剪下大小約1.0 cm×0.5 cm的尾鰭鰭條,用苯酚-氯仿抽提法提取,于4℃下保存?zhèn)溆肹26]。

1.2.2 mtDNA的D-loop及其鄰近區(qū)段的擴增及凝膠電泳 以提取的 DNA為模板,使用位于mtDNA的D-1oop區(qū)段兩側的引物對每尾試驗魚的D-loop及其鄰近區(qū)段進行擴增。所用引物為L15923:5′TTA AAG CAT CGG TCT TGT AA 3′[27]和H1067:5′ATA GTG GGG TAT CTA ATC CCA GTT 3′[28],兩個引物的結合位點分別位于tRNAThr和12S rRNA編碼區(qū)上。PCR方法與擴增片段的確認參照梁愛軍等[15]的方法。將PCR產物委托深圳華大基因科技有限公司進行測序。測序得到的序列依據峰圖進行確認。

1.3 數據處理

以從GenBank中獲得的鯉序列(X61010.1)、金魚序列(AB111951.1)、鰱序列(EU315941.1)、草 魚 序 列 (EU391390.1) 和 長 吻 鮠 序 列(GU596454.1)為參考序列,用Clustal 1.83軟件對測序結果進行同源序列比對分析[29],確定PCR擴增產物所包含的各個區(qū)段。將比對好的6種魚28個個體的序列提交到GenBank庫中獲得序列號。用Mega 4.0軟件統(tǒng)計6種魚D-loop及其鄰近區(qū)段的堿基組成和堿基差異[30],基于Kimura-雙參數計算6種魚群體間的遺傳距離[31],并依此與Gen-Bank中5種魚的序列一起構建NJ系統(tǒng)樹。

2 結果

2.1 mtDNA D-loop及其鄰近區(qū)段的PCR擴增

6種魚mtDNA D-loop及其鄰近區(qū)段的PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后,得到大小不同的擴增片段(圖1)。PCR產物電泳結果顯示條帶清晰單一,未發(fā)現非特異性條帶。其中1號草魚個體的片段長度約為1 800 bp,12、13號烏蘇里擬鲿兩個個體的片段長度約為1 500 bp,其他個體的片段長度約為1 600 bp。

圖1 6種魚mtDNA D-loop及其鄰近區(qū)段的PCR電泳圖Fig.1 The PCR electrophoretogram of mtDNA D-loop and adjacent regions in six fish species

2.2 PCR產物序列分析

將測序結果與GenBank中的序列進行比對后發(fā)現,6種魚使用引物L15923和H1067擴增出的片段包括完整的tRNAPro、D-loop、tRNAPhe序列以及12S rRNA長度約為400 bp的部分序列。將6種魚共28個個體的序列提交到GenBank中,獲得的序列號為KC292921～KC292948。確定了每種魚D-loop的位置以及片段長度。其中,鯉D-loop區(qū)段的長度為926～929 bp,鯽為925 bp,草魚為928 bp(GenBank序列號為KC292921的1號草魚個體的69號堿基插入了一段長度為231 bp的重復序列,其中包括草魚D-loop區(qū)段前部的203個堿基和tRNAPro尾部的28個堿基),鰱為933～938 bp,鳙為935～939 bp,烏蘇里擬鲿為893 bp。

2.3 6種魚序列的堿基組成與差異

2.3.1 堿基組成 用Mega 4.0計算出6種魚的D-loop區(qū)段及擴增所得全部序列的堿基頻率(表1)。每種魚的A+T含量都明顯高于G+C含量,符合mtDNA的特點,表明6種魚的堿基組成具有明顯偏向性[32-33]。

表1 6種魚D-loop區(qū)段及擴增所得序列的堿基頻率Tab.1 Nucleotide frequencies in D-loop region and amplified fragment in six fish species %

2.3.2 種內和種間的堿基差異 將6種魚進行排序比較后發(fā)現,6種魚序列結構的差異性表現在種間和種內兩方面,種間的差異性遠大于種內。而且6種魚的tRNAPro、tRNAPhe和12S rRNA三個區(qū)段的兩種差異性均遠小于D-loop區(qū)段(表2)。不同種間在D-loop區(qū)段的起始端就表現出明顯的堿基差異,與其他5種魚親緣關系較遠的烏蘇里擬鲿的差別性更加明顯。

表2 6種魚的擴增片段中種內和種間的堿基差異Tab.2 The base difference in amplified fragment between intraspecies and interspecies

2.3.3 PCR-RFLP酶切結果與序列分析的比較

使用相同引物對6種魚的mtDNAD-loop及其鄰近區(qū)段進行了RFLP分析[15,22-25](烏蘇里擬鲿的結果未發(fā)表),在序列分析結果中均找到了RFLP的相應酶切位點,印證了RFLP實驗結果。同時在酶切位點以外也發(fā)現了同種魚的不同單倍型間存在堿基差異(GenBank號:KC292921～KC292948)。

2.4 6種魚的遺傳距離與系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4.1 遺傳距離 基于 Kimura雙參數法(Kimura's 2-Parameter)計算6種魚種間D-loop區(qū)段的遺傳距離(表3)和擴增所得全部序列的遺傳距離(表4)。其中,鳙與烏蘇里擬鲿的遺傳距離最大,為0.534668;鰱與鳙的遺傳距離最小,為0.106186。

表3 6種魚D-loop區(qū)段種間的平均Kimura's 2-Parameter遺傳距離Tab.3 The genetic distance of D-loop in six species based on Kimura's 2-Parameter model

表4 6種魚擴增所得序列中種間的平均Kimura's 2-Parameter遺傳距離Tab.4 The genetic distance of amplified fragment in six species based on Kimura's-Parameter model

2.4.2 系統(tǒng)發(fā)育樹 運用Mega 4.0軟件,基于Kimura雙參數模型,進行1 000次抽樣重復檢測,將對6種魚測序所得片段與GenBank中獲得的鯉序列(X61010.1)、金魚序列(AB111951.1)、鰱序列(EU315941.1)、草魚序列(EU391390.1)和長吻鮠序列(GU596454.1)構建NJ系統(tǒng)樹,如圖2所示。結果顯示,除鰱分支的支持率為85%外,其余均在90%以上,并可明顯分出6個分支。

圖2 基于Kimura's 2-Parameter模型構建的PCR擴增片段的NJ系統(tǒng)樹Fig.2 NJ phylogenetic tree of amplified fragment based on the Kimura's 2-Parameter model

3 討論

近年來,對魚類mtDNA的研究逐步向序列分析的方向發(fā)展,序列遺傳多樣性分析及結構研究已成為D-loop區(qū)的研究重點。本試驗中運用軟件對6種魚的mtDNAtRNAPro、D-loop、tRNAPhe和部分12S rRNA序列進行分析,得到6種魚堿基含量、堿基差異、遺傳距離和NJ系統(tǒng)樹等相關數據。

與GenBank中5種魚的同源序列比對后,確定了6種魚的PCR產物中所包含的各個區(qū)段以及mtDNA D-loop區(qū)的位置和片段長度。發(fā)現6種魚D-loop區(qū)的長度在種內和種間都存在差異。吳海防等[25]報道的草魚單倍型Ⅱ比一般草魚長出一段DNA為231 bp的重復序列,基于mtDNA D-loop區(qū)段用PCR-RFLP法檢測出的草魚兩種單倍型的差異源于此重復序列。

本研究中選取了除鯽之外的5種魚mtDNA D-loop及其鄰近區(qū)段經PCR-RFLP法檢測的單倍型,經過序列分析,印證了每種魚的不同單倍型在限制酶酶切位點上的差異性,并且除酶切位點以外也存在堿基差異。經過酶切位點比對,發(fā)現單酶切之后會出現一些較小的酶切片段,這些片段在使用瓊脂糖凝膠電泳分辨時受到限制,因而可以認為,在很多用PCR-RFLP檢測分析的報道中酶切片段長度之和會小于 PCR 擴增的片段長度[13-14,23-25]。與PCR-RFLP法相比,序列分析的方法精確度更高。

6種魚序列差異性的研究證明了mtDNA的D-loop區(qū)段的變異程度比其他序列高。在6種魚的NJ系統(tǒng)樹中,親緣關系較近的鰱和鳙,鯉和鯽都可以明顯的進行區(qū)分,并且具有較高的支持率。本研究結果表明,D-loop區(qū)段或者D-loop區(qū)段結合其鄰近區(qū)段適合系統(tǒng)發(fā)育研究,并且可以為魚類種類識別以及遺傳多樣性分析等方面提供科學依據。

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The sequence comparison of mtDNA D-loop and adjacent regions in six fish species

HAO Jun,YANG Qiang,BAO Di,LIANG Ai-jun,ZHANG Xing-hua,DONG Shi

(College of Life Science,Tianjin Normal University,Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance,Tianjin 300387,China)

The mtDNA D-loop and its adjacent regions were amplified and sequenced in 28 individuals from different haplotypes detected using PCR-RFLP in Ukraine scale carp(Cyprinus carpio),crucian carp(Carassius auratus),silver carp(Hypophthalmichthys molitrix),big head carp(Aristichthys nobilis),grass carp(Ctenopharyngodon idellus)and Ussuri bullhead(Pseudobgrus ussuriensis)by PCR.The amplified fragment length of mtDNA D-loop and its adjacent regions in the fish were varied from 1 500 bp to 1 800 bp,and are compared with the mtDNA complete sequences of five fish species from GenBank by Clustal 1.83 software.It was found that the amplified fragment was comprised of complete tRNAPro,D-loop,tRNAPhesequences and about 400 bp part of the 12S rRNA sequence.Sequences of 28 individuals were submitted to GenBank for serial numbers(KC292921-KC292948), and the base composition and difference of the six species,and the genetic distance were calculated based on Kimura's 2-Parameter model and NJ phylogenetic tree with five sequences from GenBank was constructed by Mega 4.0 software.The sequence structure analysis showed that the intraspecific and interspecific differences in D-loop region were higher in the four region sequences of six species than those in other species.NJ phylogenetic trees of six species were consistent with the traditional classification methods,showing useful for fish species classification and identification.In addition,restriction sites of all kinds of haplotypes were found in sequences,which is consistent with PCR-RFLP experimental results.More variation out of the restriction sites were observed compared with RFLP analysis.

Ukraine scale carp;crucian carp;silver carp;big head carp;grass carp;Ussuri bullhead;D-loop; NJ phylogenetic tree

S965.113;Q953

A

2012-12-13

天津市動植物抗性重點實驗室開放研究基金資助項目

郝君(1987-),女,碩士研究生。E-mail:haohaojunjun2645@163.com

董仕(1959-),男,博士,研究員。E-mail:skyds@mail.tjnu.edu.cn

2095-1388(2013)02-0160-06