趙 強(qiáng)，王一洲

膝骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）是一種常見(jiàn)的慢性關(guān)節(jié)疾病，本病多見(jiàn)于中老年人，是影響中老年人生存質(zhì)量的重要因素。膝關(guān)節(jié)是負(fù)重關(guān)節(jié)，關(guān)節(jié)表面覆蓋有關(guān)節(jié)軟骨，這層軟骨組織是運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的重要組成部分，能降低關(guān)節(jié)面的摩擦系數(shù),分散關(guān)節(jié)面的壓力負(fù)荷[1]。隨著KOA的病程發(fā)展，軟骨細(xì)胞的損傷也隨之加重。研究軟骨細(xì)胞的變化是探索KOA的病因病機(jī)和治療方法的重要途徑。筆者檢索并分析了近十年國(guó)內(nèi)外軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)和其影響因素的相關(guān)文獻(xiàn)，為KOA的深入研究提供證據(jù)。

1 KOA模型的建立

KOA模型的制作方法分為兩類(lèi)，即誘發(fā)模型，如手術(shù)、關(guān)節(jié)制動(dòng)等，以及自發(fā)模型，如STR/ORT小鼠、老年拉布拉多犬等，其主要目的就是為了模擬骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病和進(jìn)展的過(guò)程，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察軟骨凋亡的誘因以及細(xì)胞代謝在分子水平的變化。

1.1 手術(shù)造模

1.1.1 Hulth造模法及改良造模法 Hulth造模法是最經(jīng)典的KOA造模方法之一，具體操作為[2]：無(wú)菌條件下，通過(guò)吸入2%Halotane麻醉，下肢伸直位于膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱切長(zhǎng)約2 cm手術(shù)窗口顯露膝關(guān)節(jié)，屈曲膝關(guān)節(jié)，向外側(cè)推開(kāi)髕骨，保護(hù)微血管及脂肪墊，然后切斷前后交叉韌帶,完整切除內(nèi)側(cè)半月板,保留關(guān)節(jié)軟骨面，逐層縫合。術(shù)后4 d給予口服鎮(zhèn)痛藥，適當(dāng)給予抗生素預(yù)防感染，4 d后不固定傷肢，自由活動(dòng)。14周后將形成較明顯KOA模型。劉獻(xiàn)祥等[3]對(duì)Hulth造模方法進(jìn)行改良：取兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，摘除內(nèi)側(cè)半月板，切斷前交叉韌帶。術(shù)后連續(xù)3 d青霉素20萬(wàn)U肌肉注射，1周后開(kāi)始每天強(qiáng)迫兔活動(dòng)0.5 h，連續(xù)16周后，模型組關(guān)節(jié)液內(nèi)白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6等炎癥因子的表達(dá)明顯升高，且膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性較好。

1.1.2 關(guān)節(jié)刻痕造模法 Marijnissen等[4]通過(guò)在狗膝關(guān)節(jié)股骨髁上刻痕，不損傷軟骨下骨，術(shù)后將對(duì)側(cè)肢體固定于軀體上，迫使手術(shù)肢體負(fù)重，每周3 d，每天4 h，共20周。40周（后20周正常負(fù)重）后，關(guān)節(jié)軟骨在組織和生化方面已形成明顯的骨性關(guān)節(jié)炎（OA）特點(diǎn)，且應(yīng)用此法復(fù)制的KOA模型具有關(guān)節(jié)穩(wěn)定性好、炎癥反應(yīng)輕的優(yōu)點(diǎn)，適用于輕度或早期KOA研究的應(yīng)用。李釗等[5]對(duì)關(guān)節(jié)刻痕法進(jìn)行改進(jìn)，手術(shù)時(shí)定位股骨髁、髕骨及髕韌帶后。緊靠髕韌帶兩側(cè)髕骨下方對(duì)準(zhǔn)股骨髁方向進(jìn)針,用小針刀在股骨髁軟骨面上刻痕,每側(cè)刻痕4~5道,然后調(diào)整方向分別在髕軟骨及脛骨平臺(tái)上刻痕，盡量不傷及半月板，每道刻痕深度不超過(guò)軟骨全層，手術(shù)后第2天即開(kāi)始每日強(qiáng)迫驅(qū)趕動(dòng)物活動(dòng)30min，驅(qū)趕動(dòng)物活動(dòng)至5周時(shí),即得明顯的骨性關(guān)節(jié)炎模型。此法可以最大限度的減少手術(shù)后的炎癥干擾，但由于手術(shù)精度較差不能避免一些操作失誤引起的誤差。

1.1.3 關(guān)節(jié)失穩(wěn)造模法 朱鴻飛等[6]將16只健康純種成年新西蘭大白兔隨機(jī)分為正常組、模型4周組、模型6周組和模型8周組，每組4只。各模型組實(shí)驗(yàn)兔于無(wú)菌條件下造成雙后肢膝內(nèi)側(cè)髕韌帶2/3缺損，術(shù)后允許其自由活動(dòng)，手術(shù)7 d后每天強(qiáng)迫活動(dòng)1 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型6周組表現(xiàn)為膝骨性關(guān)節(jié)炎早期改變，模型8周組表現(xiàn)為膝骨性關(guān)節(jié)炎中期改變。髕韌帶內(nèi)側(cè)缺損法構(gòu)建兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，能更好地再現(xiàn)因應(yīng)力異常而導(dǎo)致的膝骨性關(guān)節(jié)炎。Liu等[7]通過(guò)對(duì)犬膝關(guān)節(jié)外側(cè)施加68 N和90 N的直接外力，導(dǎo)致其膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶損傷，形成膝關(guān)節(jié)不同程度失穩(wěn)的模型，通過(guò)有限元模擬力—位移的程度，建立膝關(guān)節(jié)失穩(wěn)的不同等級(jí)，量化KOA早期應(yīng)力失常的程度和其影響。王勝等[8]用手術(shù)方法延長(zhǎng)兔髕韌帶3 mm，降低髕股關(guān)節(jié)壓力，術(shù)后6周開(kāi)始出現(xiàn)軟骨細(xì)胞增生、排列紊亂，16周時(shí)軟骨已明顯變薄，并且出現(xiàn)縱裂紋和膠原纖維增粗、斷裂。

1.2 關(guān)節(jié)注射造模 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨下骨三者合成與降解過(guò)程失衡的結(jié)果[9]。孫魯寧等[10]運(yùn)用木瓜蛋白酶誘導(dǎo)兔膝骨性關(guān)節(jié)炎，檢測(cè)注射后第2、4、6周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)相應(yīng)組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的膝關(guān)節(jié)滑膜IL-1，IL-6、白三烯的濃度，并與正常側(cè)對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)首次注射木瓜蛋白酶后4周內(nèi)炎癥因子水平變化顯著（P<0.05）。鄧宇等[11]分別以1.6%木瓜蛋白酶或Ⅱ型膠原蛋白酶溶液注入兔膝關(guān)節(jié)，并測(cè)試不同濃度的兩種蛋白酶對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的誘導(dǎo)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低劑量的膠原蛋白酶可較稍高劑量的木瓜蛋白酶誘導(dǎo)出更為嚴(yán)重的軟骨退變。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射化學(xué)物建模所需時(shí)間短，可模擬軟骨破壞的終末環(huán)節(jié)，適于軟骨病理、藥物防治的研究，尤其是對(duì)KOA炎癥反應(yīng)有較好作用的干預(yù)手段。

1.3 自發(fā)模型 Hyttinen等[12]通過(guò)在純合形式中Col2a1基因的滅活會(huì)阻止軟骨內(nèi)骨形成，導(dǎo)致小鼠軟骨基質(zhì)中Ⅱ型膠原纖維的缺失，觀察發(fā)現(xiàn)小鼠關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的變化，證明Col2a1等位基因的失活很可能導(dǎo)致被觀察的關(guān)節(jié)軟骨軟化和小鼠骨性關(guān)節(jié)炎的高患病率。Simkin等[13]通過(guò)觀察不同年齡組的犬類(lèi)關(guān)節(jié)腔的靜水壓和滲透壓發(fā)現(xiàn)，犬類(lèi)的年齡與關(guān)節(jié)液的膠滲透壓正相關(guān)。李昊[14]觀察不同年齡兔軟骨細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)成年軟骨細(xì)胞直徑大于幼年軟骨細(xì)胞直徑，小于老年軟骨細(xì)胞直徑（P＜0．01）。

2 KOA軟骨細(xì)胞培養(yǎng)

2.1 軟骨細(xì)胞分離 高效分離純凈的KOA軟骨細(xì)胞是KOA基礎(chǔ)研究的第一步，在軟骨組織工程研究中對(duì)種子細(xì)胞的數(shù)量要求巨大、生物學(xué)功能活性要求高，細(xì)胞的來(lái)源仍是未很好解決的問(wèn)題。1967年Manning和Bonner[15]首次把胰蛋白酶和膠原酶結(jié)合使用來(lái)消化關(guān)節(jié)軟骨，把軟骨細(xì)胞從堅(jiān)韌的軟骨基質(zhì)中分離出來(lái)，周強(qiáng)等[16]用三步酶消化法分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，以1 g/L胰蛋白酶和1 g/L乙二銨四乙酸（EDTA）混合液、1 g/L透明質(zhì)酸酶和2 g/LⅠ型膠原酶順序消化關(guān)節(jié)軟骨分離細(xì)胞，并檢測(cè)細(xì)胞收獲效率和存活率，關(guān)節(jié)軟骨經(jīng)三步酶消化基質(zhì)逐步解離和降解,細(xì)胞得以完全釋放和分離,每克軟骨的細(xì)胞收獲量平均為50.13×106個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞存活率平均為98.18%。李保林等[17]在剪碎的軟骨中加入0.2%Ⅱ型膠原酶5mL，過(guò)濾、離心8min，棄上清，加入5mL含有血清的DMEM培養(yǎng)液混勻以終止消化,再離心5min,棄去上清液,只留下細(xì)胞球,并加入少量含有血清的培養(yǎng)液吸打后先封口置放。原消化瓶中再加入0.2%Ⅱ型膠原酶5mL,如前法消化45min，消化后的處理同上，取得活細(xì)胞率約90%左右。周?chē)?guó)順等[18]用酶消化法分離兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，高密度單層培養(yǎng)并傳代，當(dāng)單層細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底時(shí)用0.25%的胰酶加0.02%的EDTA消化，2∶3傳代，較好的獲取大量?jī)?yōu)良軟骨細(xì)胞。

2.2 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的調(diào)控因素

2.2.1 應(yīng)力刺激 生物力學(xué)因素在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起重要作用，適度的力學(xué)載荷作用于軟骨細(xì)胞,可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖,在載荷作用下,細(xì)胞要經(jīng)歷復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)換和傳遞的過(guò)程。研究已證明許多細(xì)胞表面的離子通道在細(xì)胞膜受到機(jī)械作用數(shù)秒或數(shù)分鐘后可引起G蛋白活化、第二信使釋放、蛋白質(zhì)磷酸化、生長(zhǎng)因子的分泌、細(xì)胞骨架的變化、細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)黏附的重建、基因表達(dá)的改變等[19]。Alexopoulos等[20]用酶解的方法分離出較多的Chondron，經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)Chondron包含有較多的蛋白多糖和Ⅱ、Ⅵ、Ⅸ型膠原，其中Ⅵ型膠原為特有的膠原，對(duì)力學(xué)信號(hào)的傳導(dǎo)有重要的作用。Labelle等[21]發(fā)現(xiàn)鈣離子含量變化介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖主要通過(guò)激活瞬時(shí)受體電位途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。Vinardell等[22]對(duì)豬膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞加載10MPa靜態(tài)壓力并采用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果檢測(cè)到Sox9基因表達(dá)較未添加TGF-β培養(yǎng)組增強(qiáng)3倍，糖胺聚糖（GAG）合成也明顯增多，提示應(yīng)力可使細(xì)胞表型及相關(guān)基質(zhì)成分發(fā)生重要變化。

2.2.2 細(xì)胞因子 Ray等[23]證明活化蛋白-1（AP-1）和血清淀粉樣蛋白A激活因子-1（SAF-1）具有協(xié)同作用，可作為共活化物介導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶-9（M M P-9）基因的轉(zhuǎn)錄激活，易致炎性的c-Jun轉(zhuǎn)錄蛋白可促進(jìn)犬MMPe-1基因的表達(dá),從而加速關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解。童徐等[24]觀察炎性細(xì)胞因子IL-1β作用于SD大鼠髁突軟骨細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)源性生長(zhǎng)因子TGF-β表達(dá)的改變，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞在IL-1β作用下，TGF-β表達(dá)增加。田峰等[25]發(fā)現(xiàn)病態(tài)軟骨中 TGF-β1、IL-1β1 的表達(dá)比正常軟骨高（P＜0．05）。

3 展望

KOA是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，KOA模型的建立及軟骨細(xì)胞生理特性的的深入研究是探討骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的重要步驟。由宏觀向微觀深入、宏觀與微觀相結(jié)合是骨性關(guān)節(jié)炎基礎(chǔ)研究的基本趨勢(shì)。國(guó)內(nèi)對(duì)于軟骨細(xì)胞各種生物特性的研究才剛剛起步，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及操作方案上大多參照國(guó)外同類(lèi)實(shí)驗(yàn)，開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)更適用于國(guó)內(nèi)技術(shù)平臺(tái)和研究需要的動(dòng)物模型及軟骨細(xì)胞，尤其是利于中醫(yī)、中藥應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)材料，是目前亟待解決的問(wèn)題。希望能通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)的研究證實(shí)臨床效果顯著的中醫(yī)藥治療方法，將中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)發(fā)揚(yáng)光大。

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