石 燕，劉 凡，鄭 燚，鄭為完,3，葛 輝

(1.南昌大學食品科學與工程系，食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西師范大學計算機信息工程學院，江西 南昌 330027；3.江西維爾寶食品生物有限公司，江西 高安 330800)

微膠囊具有將液體粉末化、保護活性組分和控制芯材釋放等功能，其結構形態(tài)特征，如顆粒的孔隙、表面完整性會影響微膠囊品質，從而決定產品貨架期[1-3]。選擇合適的壁材是生產高穩(wěn)定性微膠囊的關鍵，油脂微膠囊的壁材成分主要有蛋白質與多糖[4]。蛋白質是表面活性劑，具有乳化劑的特征結構；多糖則有良好的增稠性和持水性[5]。蛋白質在微膠囊加工過程中與多糖共混，多糖的加入會對蛋白質的乳化性及乳化穩(wěn)定性產生影響[6-7]，可能原因是蛋白質和多糖之間發(fā)生了交互作用，對蛋白質的構象產生了影響。

蛋白質的構象決定其功能，傅里葉變換紅外光譜是研究蛋白質結構和功能相互關系的有力手段，蛋白質二級結構與其分子內形成的氫鍵密切相關。蛋白質的紅外吸收光譜由9個酰胺吸收帶組成，其中酰胺Ⅰ帶(1700～1600cm-1)主要包含了C＝O的伸縮振動，已廣泛應用于二級結構變化的研究，但水汽在1640cm-1附近的吸收很強，對結果準確性造成很大的影響[8]。蛋白質的酰胺Ⅲ帶(1330～1220cm-1)由于信號較弱，過去很少用于蛋白質二級結構的分析，但由于H2O在此區(qū)間無吸收，解決了水汽干擾問題，而且蛋白質不同二級結構的酰胺Ⅲ帶的光譜性質特征明顯，擬合過程中易于將其分離，彌補了酰胺Ⅰ帶中α-螺旋結構無規(guī)則卷曲難以區(qū)分的缺點[9-10]。

本實驗擬利用傅里葉紅外光譜酰胺Ⅰ帶及酰胺Ⅲ帶研究麥芽糊精與酪蛋白相互作用情況，采用吸光度光譜差減法，結合去卷積、二階導數(shù)譜和曲線擬合等數(shù)學處理方式分析酪蛋白酰胺Ⅲ帶的譜圖變化，觀察酪蛋白與麥芽糊精在微膠囊壁形成過程中酪蛋白二級結構變化情況，并比較酪蛋白與麥芽糊精相互作用后對其乳化穩(wěn)定性的影響，分析其產生原因，對微膠囊壁形成過程中麥芽糊精與酪蛋白相互作用機理進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白 美國Sigma公司；麥芽糊精(分析純) 上海青析化工科技有限公司；大豆油 中糧集團；十二烷基硫酸鈉(分析純) 天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

Nicolet Nexus FT-IR傅里葉紅外光譜儀 美國Nicolet公司；SLS高壓均質機 上海申鹿均質機有限公司；壓力噴霧干燥機 錫山市干燥機廠；BT00-100M蠕動泵常州科健蠕動泵；721型分光光度計 上海第三儀器分析廠。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白-麥芽糊精復合物制備

將酪蛋白與麥芽糊精以質量比1:2.5進行復配作為微膠囊壁材，經80℃水浴溶解，40MPa高壓均質后，進風溫度200℃、出風溫度95～97℃、蠕動泵轉速15.5r/min噴霧干燥法制備酪蛋白-麥芽糊精復合物。

1.3.2 譜圖收集

酪蛋白及其復合物在100℃烘箱中干燥2h。用KBr壓片法制樣，采用Nicolet Nexus FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀記錄干燥的蛋白質、麥芽糊精及噴霧干燥后酪蛋白-麥芽糊精復合物的紅外光譜圖，波長掃描范圍為500～4000cm-1，分辨率4cm-1，掃描次數(shù)32，收集樣品光譜。

1.3.3 譜圖處理

對添加麥芽糊精前后酪蛋白的紅外光譜變化進行減差處理([酪蛋白+麥芽糊精]－麥芽糊精)去除麥芽糊精對譜圖的影響。利用OMNIC 7.3對酪蛋白的酰胺Ⅲ帶(1330～1220cm-1)進行兩點基線校正，采用9點Savitzky-Golay平滑處理后，對光譜數(shù)據進行二階求導和傅里葉去卷積(FSD)，從而估計各子峰的峰位和半峰寬，酪蛋白的FSD曲線參數(shù)選擇譜帶寬度8.48，增強因子3.0；酪蛋白-麥芽糊精的FSD曲線參數(shù)選擇譜帶寬度7.66，增強因子3.0，使二階導數(shù)曲線和FSD曲線中的各子峰的個數(shù)和峰位基本相同。通過Origin Pro 8.0軟件對酰胺Ⅲ帶進行Gaussian曲線擬合，其殘差R2＞0.93。

1.3.4 乳化活性和乳化穩(wěn)定性測定[11-12]

分別稱取酪蛋白和酪蛋白-麥芽糊精共價復合物5g，溶于300mL去離子水中，緩慢加入大豆油10mL，使用高速分散機在2000r/min條件下分散2min，制成乳狀液，立即從乳狀液底部吸收100μL乳濁液，迅速與0.1%十二烷基磺酸鈉溶液50mL混合，混勻后在500nm波長處測定該稀釋液的吸光度A0，吸光度正比于乳濁液的液滴界面面積。因此，A0越大，蛋白質的乳化活性越高。

以t時間間隔(t依次為0、10、20、30、40、50min)從乳狀液底部用微量注射器抽取樣品100μL，立即與0.1%十二烷基磺酸鈉溶液50mL混合，然后使用分光光度計于500nm波長處讀取其吸光度At，乳化穩(wěn)定性(ES)由以下公式計算得出。

式中：A0為初始吸光度；At為tmin后的吸光度。

2 結果與分析

2.1 傅里葉紅外光譜分析

通過對比酪蛋白(圖1)、麥芽糊精(圖2)以及經加熱噴霧干燥酪蛋白-麥芽糊精復合物(圖3)的紅外光譜圖，圖1中3300.4cm-1處的吸收峰屬于酪蛋白中N—H鍵的伸縮振動吸收，2962.8cm-1的吸收峰是飽和C—H鍵的伸縮振動吸收，1654.2cm-1的吸收峰是酰胺Ⅰ帶中C＝O的伸縮振動吸收，1448.7cm-1處為C—N伸縮振動吸收，1240.9cm-1則是酰胺Ⅲ帶中N—H、C—N的無規(guī)則纏繞。圖2中3416.2cm-1處寬而強的譜帶是碳水化合物典型的締合O—H伸縮振動吸收，2926.9cm-1為飽和C—H伸縮振動，1648.2cm-1為烯烴的C＝C伸縮振動，1426.1cm-1和1370.2cm-1是C—O—H中的O—H的彎曲振動，1156.2～861.0cm-1處的吸收峰是屬于多糖中的C—O伸縮振動與環(huán)的振動，其中1022.7cm-1屬于C—O—C的不對稱伸縮振動，具有強吸收，926.5cm-1處屬于C—O—C的對稱伸縮振動，吸收峰弱，861.0cm-1屬于環(huán)振動。由圖3可知，當酪蛋白與麥芽糊精混合并經噴霧干燥后，其產物的紅外光譜既有蛋白的酰胺化合物的吸收帶特征峰，又具有碳水化合物的特征吸收峰，其中N—H鍵的伸縮振動吸收峰強度增大并向高波數(shù)移動至3384.9cm-1處，這是由于新物質共價交聯(lián)反應出現(xiàn)了新的N—H鍵，導致吸收峰強度增大，同時，N—H鍵變成＝N—H，鍵長縮短，伸縮振動波數(shù)也會增大[13]；添加麥芽糊精后，經水浴溶解和噴霧干燥后，酪蛋白酰胺Ⅰ帶移至1650.9cm-1左右，與圖2中顯示酪蛋白酰胺Ⅰ帶1654.6cm-1相比向低波數(shù)方向位移了約4cm-1，且峰的振動明顯減弱，這是由于蛋白質中氨基酸與周圍介質之間形成分子間氫鍵，氫鍵可增加分子間的作用力，有利于分子鏈的密集，當氫鍵作用較強時，C＝O的電子云密度降低，吸收帶移向低波數(shù)[14-15]，證實交聯(lián)結構的存在。

圖1 酪蛋白紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectrum of casein

圖2 麥芽糊精紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectrum of maltodextrin

圖3 酪蛋白-麥芽糊精復合物紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectrum of casein in presence of maltodextrin

反應前后的酪蛋白和麥芽糊精各自的特征吸收峰沒有明顯位移現(xiàn)象，說明反應后蛋白質分子的空間結構并沒有發(fā)生展開，只是蛋白質分子中共價結合了糖鏈來改善其功能特性。

2.2 酪蛋白酰胺Ⅲ帶的光譜分析

圖4 酪蛋白酰胺Ⅲ帶的紅外光譜(上)和高斯曲線擬合圖譜(下)Fig.4 FT-IR spectrum (upper) and Gaussian fitting curves (bottom) in the amide Ⅲ region of casein alone (a) and in presence of maltodextrin (b)

酰胺Ⅲ帶峰的歸屬如下[16]：1330～1290cm-1為α-螺旋、1290～1270cm-1為β-轉角、1270～1250cm-1為無規(guī)卷曲、1250～1220cm-1為β-折疊。根據擬合曲線(圖4)對酪蛋白的酰胺Ⅲ帶進行譜帶指認，由表1計算出與麥芽糊精相互作用后，酪蛋白的α-螺旋含量分別為5.96%和15.29%，β-折疊的含量從58.64%減少到33.12%，減少了25.52%，β-轉角含量從7.93%增加到10.83%，無規(guī)卷曲從27.47%增加至40.76%，增加了13.29%。大部分蛋白質隨著溫度的升高，α-螺旋含量會減少，無規(guī)卷曲會增加。α-螺旋和β-折疊結構中存在較多的氫鍵，導致規(guī)則二級結構具有一定的剛性，β-轉角和無規(guī)卷曲中不存在氫鍵或其他相互作用，使分子表現(xiàn)出較大的柔性[17]。微膠囊壁在形成過程中要經過加熱和高壓均質處理，使得蛋白質二級結構向無序結構轉變，但α-螺旋含量的增加可能說明了蛋白質和麥芽糊精發(fā)生交聯(lián)反應生成了氫鍵，C＝O…H—N氫鍵使蛋白質形成α-螺旋。

表1 酪蛋白酰胺Ⅲ譜帶曲線擬合結果及譜帶指認Table 1 Infrared band positions, band areas determined by Gaussian curve fitting and band assignments in the amide Ⅲ spectral region of sodium caseinate

2.3 麥芽糊精對酪蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，添加麥芽糊精后，酪蛋白的乳化活性有一定程度的增加。隨著時間的延長，酪蛋白的乳化穩(wěn)定性逐步下降，在50min時間內，酪蛋白-麥芽糊精復合物的乳化穩(wěn)定性均高于酪蛋白(圖6)，這可能是由于兩者結合后酪蛋白的α-螺旋含量增加的緣故，由于大部分α-螺旋結構具有兩親性，一側被疏水側鏈占據，另一側被親水殘基占據，有利于蛋白質在油-水界面膜上的快速吸附和定向[18]；另外，兩者結合后，無序結構含量增加也導致蛋白質柔性增加，而蛋白質在界面的吸附與分子柔性有關，酪蛋白和麥芽糊精作用分子柔性增大，也有利于蛋白質在界面上發(fā)生廣泛的構象轉變[19]。

圖5 麥芽糊精對酪蛋白乳化活性的影響Fig.5 Effect of maltodextrin on the emulsifying activity of casein

圖6 麥芽糊精對酪蛋白乳化穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of maltodextrin on the stability of casein emulsion

3 結 論

酪蛋白作為微膠囊的壁材與麥芽糊精混合后，經高壓均質和噴霧干燥后，其乳化活性和乳化穩(wěn)定性都有了一定的提高。微膠囊壁形成過程中酪蛋白紅外光譜測定結果表明酰胺Ⅰ帶發(fā)生了紫移，酪蛋白中氨基酸與周圍介質之間形成分子間氫鍵，證實有交聯(lián)結構的存在。通過擬合曲線對酪蛋白的酰胺Ⅲ帶進行譜帶指認結果表明：酪蛋白與麥芽糊精作用后，其二級結構發(fā)生了改變，其中：α-螺旋含量增加了9.33%，β-折疊含量減少了25.52%，β-轉角含量增加2.90%，無規(guī)卷曲含量增加了13.29%。無序結構從35.40%增加到51.59%，增加了16.19%，進一步證明蛋白質和麥芽糊精發(fā)生交聯(lián)反應生成了氫鍵。結合酪蛋白的柔性增加，麥芽糊精的加入對維持蛋白質α-螺旋是有益的，α-螺旋的增加和無序結構含量的增加可能是造成酪蛋白-麥芽糊精復合物乳化性和乳化穩(wěn)定性提高的因素。

[1]CHOI M, RUKTANONCHAI U, MIN S, et al.Physical characteristics of fish oil encapsulated byβ-cyclodextrin using an aggregation method or polycaprolactone using an emulsion-diffusion method[J].Food Chemistry, 2010, 119: 1694-1703.

[2]TOMITA S, SATO K, ANZAI J.Preparation of dendrimer-loaded microcapsules by a layer-by-layer deposition of polyelectrolytes[J].Materials Science and Engineering C, 2009, 29: 2024-2028.

[3]馬云標, 周慧明, 朱科學.VE微膠囊的制備及性質研究[J].食品科學, 2010, 31(2): 1-5.

[4]楊佳, 候占群, 賀文浩.微膠囊壁材的分類及其性質比較[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2009, 35(5): 122-127.

[5]熊拯, 郭興鳳, 談天.蛋白質-陰離子多糖相互作用研究進展[J].糧食與油脂, 2006(10): 15-17.

[6]齊軍茹, 楊曉泉, 彭志英.蛋白-多糖復合物的制備及乳化性能的研究[J].中國糧油學報, 2004, 19(2): 75-78.

[7]胡坤, 方少瑛, 王秀霞.大豆分離蛋白-麥芽糊精Maillard反應共聚物的乳化特性研究[J].食品工業(yè)科技, 2005, 26(6): 72-75.

[8]BARTH A.Infrared spectroscopy of proteins[J].Biochimica et Biophysica Acta, 2007, 1767: 1073-1101.

[9]謝孟峽, 劉媛.紅外光譜酰胺Ⅲ帶用于蛋白質二級結構的測定研究[J].高等學校化學學報, 2003, 24(2): 226-231.

[10]翁詩甫.傅里葉變換紅外光譜分析[M].2版.北京: 化學工藝出版社,2009.

[11]張根生, 岳曉霞, 李繼光, 等.大豆分離蛋白乳化性影響因素的研究[J].食品科學, 2006, 27(7): 48-51.

[12]PEARCE K N, KINSELLA J E.Emulsifying properties of proteins:evaluation of a turbiditmetric technique[J].Agric Food Chemistry,1978, 26: 716-723.

[13]張付利, 敬永生, 宋麗.曲克蘆丁對血清白蛋白溶液二級結構影響的研究[J].藥物分析雜質, 2011, 31(1): 75-78.

[14]顧小紅, 孟旭, 湯堅.豆?jié){凝固過程中大豆蛋白質二級結構的研究[J].分析科學學報, 2006, 22(6): 675-678.

[15]曹棟, 史蘇佳, 張永剛, 等.酰胺Ⅰ帶酰胺Ⅲ帶測定花生磷脂酶D的α-螺旋和β-折疊含量[J].化學通報, 2008(11): 877-880.

[16]蔣艷, 武培怡.大豆蛋白的中紅外和近紅外光譜研究[J].化學進展,2009, 21(4): 705-714.

[17]涂宗財, 王輝, 劉光憲, 等.動態(tài)超高壓微射流對卵清蛋白微觀結構的影響[J].光譜學與光譜分析, 2010, 30(2): 495-498.

[18]FENNEMA O R.Food chemistry[M].北京: 中國輕工業(yè)出版社,2003: 281.

[19]謝筆鈞.食品化學[M].北京: 科學出版社, 2004: 274.