宋紅平，李 梅，馮 琳，安曉娟，李師翁*

(蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

Lovastatin是1979年Endo[1]從紅曲霉(Monascus ruber)的培養(yǎng)液中分離出的一種能夠強力抑制膽固醇合成的生物活性物質(zhì)，已知其主要產(chǎn)生菌有Monascus ruber、Aspergillus terreus、Penicillium citrinum等。Lovastatin的主要作用是在體內(nèi)競爭性的抑制膽固醇合成的限速酶3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA，HMG-CoA)的活性，從而阻斷內(nèi)源性膽固醇的合成，使膽固醇的合成大大減少[2]。Lovastatin具有多重的藥理作用，對多種慢性疾病有顯著療效，如代謝性綜合癥、多種位點專一性癌變、骨質(zhì)疏松、老年性癡呆、帕金森癥、多種組織硬化和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[3]。

目前，誘變育種是工業(yè)微生物菌種選育的有效方法，常見的誘變方法有物理誘變、化學(xué)誘變、空間技術(shù)誘變和復(fù)合誘變等。紫外線誘變主要原理是使DNA分子形成嘧啶二聚體，二聚體出現(xiàn)會減弱雙鍵間氫鍵的作用，并引起雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對，從而引起突變堿基轉(zhuǎn)換(conversion)、顛換(transversions)、移碼突變(frameshift mutations)或缺失(deletions)等，靳建忠等[4]利用紫外線誘變出芽短梗霉選出高產(chǎn)普魯蘭糖白化突變菌株。紫外線與物理、化學(xué)方法復(fù)合誘變已廣泛應(yīng)用于微生物育種中，周波等[5]利用紫外線與化學(xué)誘變劑復(fù)合誘變篩選出一株高產(chǎn)紅曲黃色素菌株。重離子束作為一種新的輻射誘變育種源，在新品種選育中具有重要的獨特應(yīng)用效果。重離子束可導(dǎo)致水稻的miRNA和特異性miRNAs發(fā)生改變，通過基因表達顯示出不同的性狀[6]。本實驗室利用蘭州重離子加速器重離子裝置產(chǎn)生的重離子束對A.terreusCA99的孢子進行了輻照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重離子束能使土曲霉孢子發(fā)生變異。為了進一步提高Lovastatin的產(chǎn)量，本實驗在前面實驗的基礎(chǔ)上，以菌株A.terreusCA99為出發(fā)菌株，用重離子束和紫外復(fù)合誘變的方法對A.terreusCA99進行誘變，以期獲得高產(chǎn)Lovastatin菌株。

1 材料與方法

1.1 出發(fā)菌株

土曲霉(Aspergillus terreusCA99)，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物生理研究室提供。

1.2 培養(yǎng)基

斜面/平板培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖50、玉米粉10、氯化鈉2、磷酸二氫鉀0.5、硫酸鎂0.5，pH值自然；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米粉10、氯化鈉2、硝酸鈉2、磷酸二氫鉀0.5、硫酸鎂0.5，甘油30mL，pH值自然。

1.3 孢子懸液的制備

將菌株CA99在PDA培養(yǎng)基上30℃活化培養(yǎng)5～6d，用無菌水沖洗菌種斜面, 移入三角瓶中，并加入1～2滴0.02%的Triton X-100及玻璃珠，180r/min振蕩1h，4層無菌濾紙過濾，在血球計數(shù)板下計數(shù)，制成1×106個/mL的孢子懸液。

1.4 重離子束誘變

重離子束誘變在中國科學(xué)院近代物理研究所蘭州重離子研究裝置(HIRFL)上進行。以40mm能量為80MeV/u12C6+重離子束垂直輻照孢子懸液，劑量分別為5、10、15、20、25、30Gy，每個劑量設(shè)置3個平行，劑量數(shù)據(jù)獲取及樣品更換由計算機控制[7]。將重離子束誘變處理過的孢子懸液稀釋至10-3和10-4，吸取100μL涂布于PDA平板培養(yǎng)基上，每一稀釋倍數(shù)設(shè)置3個平行，以未誘變的孢子懸液為對照，30℃避光培養(yǎng)5d，計算致死率。

1.5 紫外線誘變

將重離子誘變篩選得到的高產(chǎn)菌株制備孢子懸液，無菌超凈工作臺中吸取孢子懸浮液5mL于帶磁力攪拌子的平皿中，打開皿蓋，置于磁力攪拌器上，15W紫外燈垂直距離15cm處，磁力攪拌下照射時間分別為30、60、90、120、150、180s。將紫外線照射后的孢子懸液稀釋至10-3和10-4，吸取100μL涂布于PDA平板培養(yǎng)基上，每個稀釋倍數(shù)設(shè)置3個平行，以未誘變的孢子懸液為對照，30℃避光培養(yǎng)5d，計算致死率。

1.6 誘變菌株的初篩和復(fù)篩

將經(jīng)過輻照處理的孢子懸液稀釋至10-3和10-4，吸取100μL涂布在固體平板培養(yǎng)基上，每個稀釋度涂布3個平皿，在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4d，挑取生長較快的單菌落接入試管斜面培養(yǎng)基保存。將初篩得到的菌株接入20mL液體種子培養(yǎng)基中，30℃搖瓶培養(yǎng)24h，再以10%的接種量接入50mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、150r/min搖瓶培養(yǎng)15d，測定發(fā)酵液中Lovastatin的含量，篩選產(chǎn)量高的菌株。

1.7 Lovastatin產(chǎn)量的測定

1.7.1 定性分析

薄層層析法：將搖床培養(yǎng)15d的菌株發(fā)酵液經(jīng)超聲波和乙酸乙酯提取后，再經(jīng)過柱層析分離，提取純化后的Lovastatin樣品和標準品一起進行硅膠薄層層析，再經(jīng)過磷鉬酸染色后觀察斑點的位置和大小。紫外分光光度法：將提純后的Lovastatin樣品用75%乙醇溶解后，以75%的乙醇為對照，用紫外分光光度計進行掃描，掃描波長范圍226～260nm。如果在231、238、246nm波長附近有最大吸光度，表明有Lovastatin存在。紅外光譜法：將Lovastatin標準品和突變A.terreusUV150-3發(fā)酵液提取獲得的Lovastatin樣品，分別用KBr壓片后用紅外光譜分析儀VERTEX 70進行紅外光譜檢測。

1.7.2 定量測定

按照文獻[7]方法進行，采用雙波長紫外分光光度法，排除樣品中色素的干擾，在246nm和254nm雙波長處快速測定發(fā)酵液中Lovastatin的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 重離子束誘變結(jié)果

圖1 重離子照射對A.terreus CA99孢子的致死率Fig.1 Effect of heavy-ion irradiation on the spores survival of A.terreus CA99

由圖1可知，重離子束輻照強烈影響A.terreusCA99孢子的生活力，致死率隨輻照劑量的增加而增加，輻照劑量大于20Gy時，致死率增加的速度減緩，30Gy時致死率達99.9%。通常情況下，將存活率大于30% (致死率大于70%)的輻照劑量，作為誘變育株的參考劑量，重離子對土曲霉的致死率在70%以上的有效致死劑量在15～30Gy。

圖2 重離子輻照后初篩的16株菌株的Lovastatin產(chǎn)量Fig.2 Lovastatin yields of 16 strains screened by heavy-ion irradiation

由圖2可知，重離子束輻照后的孢子經(jīng)過初篩得到的16株菌株，通過液體搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，得到7株Lovastatin產(chǎn)量高于出發(fā)菌株A.terreusCA99的誘變菌株，產(chǎn)量明顯提高的是A.terreusZ30-3、A.terreusZ15-6、A.terreusZ15-7和A.terreusZ15-9，其中A.terreusZ15-9的產(chǎn)量最高，為735.00mg/L，是出發(fā)菌株(171.20mg/L)的4.29倍。因此，將A.terreusZ15-9進行下一步的紫外誘變。

2.2 紫外線誘變結(jié)果

圖3 紫外線照射時間對A.terreus Z15-9孢子的致死率Fig.3 Effect of ultraviolet irradiation time on the spores survival of A.terreus Z15-9

由圖3可知，紫外線對菌株的致死率與照射強度和照射時間有關(guān)。在15W紫外燈垂直距離15cm處照射，隨著紫外線照射時間的延長，菌株A.terreusZ15-9的致死率不斷增大，照射時間在100～180s范圍內(nèi)，A.terreusZ15-9的致死率都大于80%，表明在此時間范圍進行輻照，誘變效果更好。

圖4 紫外線誘變后初篩得到的19株菌株的LovastatinFig.4 Lovastatin yields of 19 mutants screened by ultraviolet radiation

由圖4可知，紫外線照射后經(jīng)初篩得到19株菌株，通過搖瓶發(fā)酵進行復(fù)篩，得到3株產(chǎn)Lovastatin產(chǎn)量高于出發(fā)菌株A.terreusZ15-9誘變株，分別是A.terreusUV150-1、A.terreusUV150-3、A.terreusUV150-4，其中A.terreusUV150-3菌株的Lovastatin產(chǎn)量最高，為966.32mg/L是A.terreusZ15-9菌株(735.00mg/L)的1.31倍。因此，將A.terreusUV150-3作為最終菌株進行進一步研究。

將重離子誘變和紫外誘變后的菌株A.terreusUV150-3接種于PDA平板培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～6d后，有大量的土黃色的孢子產(chǎn)生，誘變后菌落生長較快，外周有大量白色菌絲產(chǎn)生。用接種針從斜面或發(fā)酵液中挑取少量菌絲，制作菌絲裝片，在顯微鏡下觀察，A.terreus的菌絲分支較多，為有隔菌絲，其內(nèi)含物及孢子呈淺綠色，具典型的分生孢子梗。誘變后的菌株相比原菌株菌絲變細，內(nèi)含物排列不規(guī)整，孢子和孢子梗的形態(tài)沒有發(fā)生變化。

2.3 A.terreus UV150-3菌株的液態(tài)培養(yǎng)特性

將A.terreusUV150-3菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行液態(tài)搖瓶發(fā)酵，菌絲團成球狀，在發(fā)酵前3d左右菌球呈白色，整個發(fā)酵液呈淡綠色，隨著培養(yǎng)時間的延長，發(fā)酵液顏色逐漸變深，菌絲球也越來越大。發(fā)酵結(jié)束后，整個發(fā)酵液呈現(xiàn)土黃色略帶紅色。研究表明Lovastatin的生物合成與菌絲球的結(jié)構(gòu)和大小有一定關(guān)系，緊湊的菌形和小菌絲球更有利于其合成，同時在繁殖期生物量也達到最高，最適菌絲球大小直徑在0.85～1.05mm之間，這與Lai等[8]的研究結(jié)果一致。Bizukojc等[9]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)土曲霉孢子的菌落直徑小于1.5mm的菌絲球可以使Lovastatin的產(chǎn)量達到最大，孢子數(shù)量小于2×109個時生物量達到最大。

圖5 A.terreus UV150-3的生長曲線Fig.5 Growth curve of A.terreus UV150-3

由圖5可知，將A.terreusUV150-3接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，前3d每隔24h測定其生物量，之后每隔3d測定1次，并用雙波長紫外分光光度法測定其Lovastatin產(chǎn)量。菌株A.terreusUV150-3在前6d生長較快，9d以后菌株生長進入穩(wěn)定期。

圖6 A.terreus UV150-3的產(chǎn)物曲線Fig.6 Lovastatin production of A.terreus UV150-3

由圖6可知，前6d Lovastatin產(chǎn)量較低，這一階段主要是菌株自身的生長，隨著培養(yǎng)時間的延長，發(fā)酵液中Lovastatin的產(chǎn)量也逐漸增加，當(dāng)達到15d后，Lovastatin產(chǎn)量趨于穩(wěn)定，造成此現(xiàn)象的原因是發(fā)酵培養(yǎng)基中的養(yǎng)分已被消耗，菌體代謝產(chǎn)物逐漸增多。文獻報道[10-12]中，土曲霉發(fā)酵產(chǎn)Lovastatin的最佳發(fā)酵時間在10d左右，本實驗中最佳發(fā)酵時間為15d。

2.4 A.terreus UV150-3發(fā)酵液中Lovastatin的定性分析

圖7 Lovastatin樣品與標準品的薄層層析Fig.7 Thin layer chromatography of lovastatin standard and lovastatin samples

圖8 Lovastatin樣品的紫外掃描圖譜(75%乙醇)Fig.8 UV spectrum of lovastatin sample (in 75% ethanol)

從圖7薄層層析圖可以看出，與標準品有相同位移的洗脫液表明有Lovastatin的存在。由圖8紫外掃描可看出，用75%乙醇溶解經(jīng)柱層析得到的Lovastatin樣品，在230、238nm和246nm處有3個紫外吸收峰，這與文獻報道[13]的用紫外檢測Lovastatin在229、237nm和246nm波長處有最大吸收峰相同。Lovastatin的紅外光譜在3550、2970、1696cm-1和1220cm-1處有特征吸收峰[13]，本實驗在室溫下用溴化鉀壓片法測定Lovastatin樣品和標準品的紅外光譜(圖9)，A.terreusUV150-3菌株產(chǎn)生的Lovastatin樣品的紅外光譜特征吸收峰為3539.98、2928.53、1700.37、1219.63cm-1，與標準Lovastatin特征吸收峰3540.63、2965.37、1699.64、1220.01cm-1一致。因此，通過薄層層析、紫外掃描圖譜及紅外圖譜可以得出A.terreusUV150-3菌株的發(fā)酵液中含有Lovastatin。

圖9 Lovastatin樣品與標準品的紅外吸收光譜Fig.9 IR spectra of lovastatin samples and lovastatin standard (KBr)

2.5 A.terreus UV150-3的遺傳穩(wěn)定性

為了考察誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性，對菌株A.terreusUV150-3連續(xù)傳代培養(yǎng)5代，每代進行搖瓶發(fā)酵，并重復(fù)3次測定Lovastatin的產(chǎn)量及生物量。由表1可知，培養(yǎng)5代A.terreusUV150-3發(fā)酵液中Lovastatin的產(chǎn)量穩(wěn)定在960mg/L左右，生物量也比較穩(wěn)定，說明菌株A.terreusUV150-3有較好的遺傳穩(wěn)定性。

表1 A.terreus UV150-3產(chǎn)Lovastatin遺傳穩(wěn)定性(±s, n＝3)Table 1 Genetic stability of A.terreus UV150-3 (±s, n＝3)

表1 A.terreus UV150-3產(chǎn)Lovastatin遺傳穩(wěn)定性(±s, n＝3)Table 1 Genetic stability of A.terreus UV150-3 (±s, n＝3)

指標 傳代次數(shù)1 2 3 4 5 Lovaststin產(chǎn)量/(mg/L)生物量/(g/100mL)966.32±5.11 0.639±0.009 970.12±7.03 0.640±0.010 953.35±10.33 0.647±0.013 962.90±9.80 0.644±0.007 959.20±2.34 0.645±0.004

3 討論與結(jié)論

目前，產(chǎn)Lovastatin的絲狀真菌有Monascus、Aspergillus和Penicillium等，其中以Monascus ruber、Monascus pilosus、Aspergillus terreus、Aspergillus flavipes等廣泛用于研究和生產(chǎn)。但Lovastatin的野生菌株一般產(chǎn)量都很低，因此運用誘變育種的方法來獲得優(yōu)良菌株的研究越來越受到重視，并取得了一定的研究結(jié)果[14]。蔣世春[15]用微波等離子體(N+20W)誘變方法，篩選到一株最高產(chǎn)率為對照菌株的118.7%的高產(chǎn)菌株N-28，并進行傳代產(chǎn)量穩(wěn)定性實驗，經(jīng)發(fā)酵工藝條件優(yōu)化，在培養(yǎng)過程中改變碳氮比例，添加適量的甲硫氨酸，最終Lovastatin的產(chǎn)率提高21.8%。陳芝等[16]將高產(chǎn)Lovastatin的A.terreus與低產(chǎn)的M.anka進行原生質(zhì)體融合，篩選得到高產(chǎn)的融合子。近年來，基因工程技術(shù)的應(yīng)用，大大提高了微生物菌種的選育的效率。但傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變方法，因其具有簡單、快速、有效等優(yōu)點，至今仍被廣泛使用。本研究采用重離子和紫外線復(fù)合誘變的方法，對Aspergillus terreusCA99，通過初篩復(fù)篩選出了一株高產(chǎn)Lovastatin菌株A.terreusUV150-3，其產(chǎn)量高達966.32mg/L，較原始出發(fā)菌株A.terreusCA99 (171.20mg/L)提高了4.6倍，且遺傳穩(wěn)定性良好。

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