張 敏，周 梅

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100037；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

自由基是單獨(dú)存在的具有不成對(duì)價(jià)電子的分子、原子、離子和基團(tuán)。自由基包括氧自由基和非氧自由基，氧自由基占95%，如超氧陰離子自由基()、羥自由基(·OH)、過(guò)氧羥基自由基(HOO·)以及來(lái)自于脂質(zhì)過(guò)氧化物的有機(jī)自由基(R·)和有機(jī)過(guò)氧自由基(ROO·)[1]。根據(jù)現(xiàn)有的研究報(bào)道，許多疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、肝硬化、癌癥以及關(guān)節(jié)炎、白內(nèi)障、人體衰老等過(guò)程都與自由基的作用有關(guān)[2]。因此保持機(jī)體自由基的產(chǎn)生與消除的平衡，防止自由基對(duì)細(xì)胞和組織的損傷，是預(yù)防各種疾病的有效措施之一?？寡趸镔|(zhì)是防病治病的關(guān)鍵物質(zhì)，但一些人工的合成抗氧化劑，如叔丁基羥基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)等，能夠抑制人體的呼吸酶活性，使用過(guò)量甚至可致畸、致癌，有些國(guó)家已禁止使用[3]，因此研究天然、低毒、高效抗氧化劑的工作一直是食品和生物領(lǐng)域的重要課題。

我國(guó)是稻米生產(chǎn)大國(guó)，但是米糠的利用率很低，米糠中含有20%左右的蛋白質(zhì)，米糠蛋白質(zhì)中必需氨基酸的含量和相互比值也符合人體的需要，尤其適合于生長(zhǎng)速度快以及胃消化功能尚不完全的嬰兒。且米糠蛋白質(zhì)還具有低過(guò)敏性，可作為低敏性蛋白質(zhì)原料用于嬰幼兒食品中[4]。

基于米糠蛋白的這一系列優(yōu)點(diǎn)，近些年來(lái)，對(duì)米糠多肽的活性研究也成為了熱點(diǎn)。2007年，張強(qiáng)等[5]用胰蛋白酶制備的米糠抗氧化肽有很強(qiáng)的還原力，對(duì)·和·OH有很強(qiáng)的清除作用，且呈一定的量效關(guān)系。2008年，丁青芝等[6]用8種酶水解米糠蛋白制備降血壓肽，最終獲得ACE抑制率88.8%和水解度4.76%的降血壓肽。2009年，國(guó)外學(xué)者Chanput 等[7]用胃蛋白酶水解米糠獲得由6～30個(gè)氨基酸殘基組成的分子質(zhì)量在670～3611D的抗氧化活性蛋白肽，最高活性組分主要為Tyr-Leu-Ala-Gly-Met-Asn；米糠抗氧化肽不僅對(duì)自由基具有較強(qiáng)的清除作用，而且無(wú)任何毒副作用。2010年，林敏剛等[8]用木瓜蛋白酶制備的米糠生物活性肽對(duì)·OH具有良好的清除能力。2010年，樊金娟等[9]對(duì)米糠抗氧化肽體外抗氧化作用進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，0.32mg/mL米糠抗氧化肽能夠抑制血紅蛋白氧化反應(yīng)和紅細(xì)胞溶血，抑制率為50%左右。

現(xiàn)在測(cè)定抗氧化能力的方法很多，但還沒(méi)有一種方法可以完全地評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力，主要原因是由于生物體中有多個(gè)抗氧化系統(tǒng)，這些存在于體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)的工作原理、相互之間的關(guān)系還沒(méi)有搞清楚，所以很難對(duì)抗氧化物質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)；存在的多種自由基和抗氧化劑資源，它們各自都有不同的化學(xué)和物理特征。某一抗氧化劑可能在單一系統(tǒng)中同時(shí)有多重機(jī)制，或者在不同系統(tǒng)中表現(xiàn)出不同的機(jī)制。此外，對(duì)于不同的自由基，抗氧化劑的清除機(jī)制也不相同?，F(xiàn)在采用的抗氧化評(píng)定方法大多為體外抗氧化測(cè)定，無(wú)法真實(shí)模擬生理環(huán)境，且各方法都僅測(cè)定了抗氧化能力中的某一方面，故無(wú)法模擬生理?xiàng)l件下的多條抗氧化途徑；測(cè)定的樣品大多為混合物質(zhì)，其成分非常復(fù)雜，各抗氧化物質(zhì)的抗氧化作用無(wú)法用單一的機(jī)制解釋[10-11]。因此，目前測(cè)定抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力常選用不同類型的測(cè)定指標(biāo)。根據(jù)抗氧化物質(zhì)的作用機(jī)理可將這些指標(biāo)分為4類：1)活性氧自由基清除能力，包括·OH和·；2)基于氫原子轉(zhuǎn)移(HAT)的方法，包括氧自由基吸收能力(ORAC)、硫代巴比妥酸反應(yīng)物法(TBARS)、硫酸氰鐵法(FTC)；3)基于電子轉(zhuǎn)移(SET)的方法，包括DPPH自由基清除能力、ABTS+·清除能力、FRAP(Fe3+還原能力)、總酚估計(jì)法；4)金屬離子螯合能力法。

本研究以米糠蛋白為原料，選用堿性蛋白酶酶解米糠蛋白制備米糠多肽，并對(duì)米糠多肽進(jìn)行超濾，截留出分子質(zhì)量大于10kD、3～10kD、小于3kD的米糠多肽產(chǎn)品，對(duì)其分別進(jìn)行抗氧化活性的研究。在實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)抗氧化物的抗氧化機(jī)理不同選擇6種測(cè)定抗氧化能力的方法[12-13]，在不同的機(jī)制上表征米糠多肽的抗氧化活性體系。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

米糠蛋白(蛋白含量71.51%、水分含量4.40%、灰分含量2.61%、碳水化合物15.64%、淀粉含量3.4%，脂肪含量＜1%) 黑龍江省北大荒米業(yè)有限公司。

Alcalase蛋白酶(235000U/g) 丹麥諾維信公司；DA2012-C大孔吸附樹脂 江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)有限公司；ABTS+·清除能力檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

722型可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；K5600超微量分光光度計(jì) 北京凱奧科技發(fā)展有限公司；AKTAexplorer層析儀 德國(guó)GE Healthcare公司；超濾離心管 美國(guó)Milipore公司。

1.2 方法

1.2.1 米糠多肽的制備

米糠蛋白→配制底物質(zhì)量濃度為5g/100mL的原料液→50℃恒溫水浴→酶解3h→滅酶(沸水浴5min)→12000r/min離心10min→取上清進(jìn)行脫鹽處理(粗提液)→超濾(截留分子質(zhì)量＞10kD、3～10kD、＜3kD)→抗氧化活性分析測(cè)定

1.2.2 大孔樹脂純化米糠多肽

將一定量的樹脂用無(wú)水乙醇浸泡24h，然后用無(wú)水乙醇洗至220nm無(wú)吸收峰時(shí)，再用去離子水洗凈后備用。稱取100g濕樹脂于250mL錐形瓶中，加100mL米糠多肽，25℃恒溫?fù)u床150r/min，使其充分吸附后棄去未吸附的鹽溶液，用75%乙醇依次洗脫，分別收集洗脫液并濃縮得到初步的純化，脫除大部分鹽和糖的米糠多肽產(chǎn)品。

將不同分子質(zhì)量的米糠多肽配制成質(zhì)量濃度為0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6mg/mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 水解液中含氮量(以蛋白質(zhì)含量計(jì))

采用福林-酚法[14]測(cè)定多肽含量，以牛血清蛋白為標(biāo)樣，回歸方程為：Y=904.93x+0.9162(R2=0.9991)，式中，Y為蛋白質(zhì)量濃度/(μg/mL)；x為吸光度。

1.2.4 ·OH清除能力的測(cè)定[15]

利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH與甲基紫作用前后測(cè)定244nm波長(zhǎng)吸光度的變化來(lái)計(jì)算清除率。5mL甲基紫溶液吸光度為A；混合液吸光度為A0；樣品反應(yīng)后吸光度為AS。清除率按式(1)進(jìn)行計(jì)算。

采用鄰苯三酚自氧化法略有改動(dòng)[13]，加入各種試樣，在420nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。清除率按式(2)進(jìn)行計(jì)算。

式中：A空白為pH 8.2Tris-HCl 6mL＋1mL 7mmol/L PR＋8mol/L HCl兩滴，用蒸餾水定容至10mL；A樣品為pH8.2 Tris-HCl 6mL＋2mL樣品＋1mL7mmol/L PR＋8mol/L HCl兩滴，用蒸餾水定容至10mL；A本底為pH8.2 Tris-HCl 6mL＋2mL樣品＋8mol/L HCl兩滴，用蒸餾水定容至10mL。

1.2.6 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

按照參考文獻(xiàn)[16]，黑暗室溫條件下放置30min后在517nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，清除率按式(3)計(jì)算。

式中：A0為1.5mL DPPH+1.5mL乙醇；A1為1.5mL DPPH+1.5mL樣品水解液；A2為1.5mL乙醇+1.5mL樣品水解液。

1.2.7 Fe3+還原能力的測(cè)定[17]

在試管中分別加入不同質(zhì)量濃度樣品、磷酸鹽緩沖溶液和鐵氰化鉀，水浴后加入三氯乙酸、蒸餾水和三氯化鐵溶液。樣品在700nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。反應(yīng)物的吸光度增加表明還原力增強(qiáng)。

1.2.8 ABTS+·清除能力的測(cè)定

采用試劑盒在414nm波長(zhǎng)處測(cè)定ABTS+·的吸光度即可計(jì)算出樣品的總抗氧化能力。以Trolox為標(biāo)樣，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y= 1.6166－1.6824x(R2=0.9974)，式中，Y為標(biāo)準(zhǔn)品Trolox的濃度/(mmol/L)；x為吸光度。

1.2.9 Fe3+螯合能力的測(cè)定

采用磺基水楊酸顯色法[18]。螯合能力按式(4)計(jì)算。

式中：X為每克樣品螯合Fe3+能力/(mg/g)；V為樣品消耗硫酸鐵銨溶液的體積/mL；c為硫酸鐵銨溶液的濃度/(mol/L)；m為樣品質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 米糠蛋白和米糠多肽對(duì)·OH的清除作用

圖1 米糠蛋白和米糠多肽對(duì)·OH清除能力Fig.1 Hydroxyl radical scavenging activity of rice bran protein and rice bran polypeptides

由圖1可知，不同質(zhì)量濃度不同分子質(zhì)量的米糠多肽對(duì)Fenton試劑系產(chǎn)生的·OH均具有清除作用，隨著質(zhì)量濃度的提高不同分子質(zhì)量的米糠多肽對(duì)·OH的清除率也隨之提高；質(zhì)量濃度在0.3～1.2mg/mL時(shí)Mw＞10kD的米糠多肽的清除率最高為35.94%，質(zhì)量濃度在2.4～4.8mg/mL時(shí)Mw為3～10kD的米糠多肽的清除率最高為47.18%，質(zhì)量濃度在9.6mg/mL時(shí)Mw＞10kD的米糠多肽的清除率最高為53.38%，Mw為3～10kD和Mw＜3kD的米糠多肽的清除率也達(dá)到最高分別為48.67%和45.85%；米糠蛋白對(duì)·OH的最大清除率為15.47%，明顯低于米糠多肽的·OH清除率；在不同分子質(zhì)量的米糠多肽中，隨著分子質(zhì)量的增加，米糠多肽的清除率增加，只有在2.4～4.8mg/mL時(shí)Mw為3～10kD的米糠多肽表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除率，質(zhì)量濃度＜2.4mg/mL以后此分子質(zhì)量的的米糠多肽，清除率的增加不顯著。由圖1、2對(duì)比可知，質(zhì)量濃度9.6mg/mL的Mw＞10kD的米糠多肽相當(dāng)于質(zhì)量濃度0.06mg/mL的VC和BHT對(duì)·OH的清除能力。

圖2 VC和BHT對(duì)·OH的清除能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging activity of vitamin C and BHT

由Fenton反應(yīng)所生成的·OH能使氨基酸發(fā)生氧化修飾，即構(gòu)成蛋白質(zhì)的多肽和氨基酸能捕捉活性氧，隨之發(fā)生自由基連鎖反應(yīng)的終止[19]，這種性質(zhì)意味著Mw＞10kD的米糠多肽屬于清除自由基捕捉型的氧化劑，在活性氧、自由基的防御系統(tǒng)中起到阻斷連鎖反應(yīng)的作用，屬于活性氧自由基清除能力的作用機(jī)制。

2.2 米糠蛋白和米糠多肽對(duì)·的清除作用

圖3 米糠蛋白和米糠多肽對(duì)·的清除能力Fig.3 Superoxide anion radical scavenging activity of rice bran protein and rice bran polypeptides

圖4 VC和BHT對(duì)·的清除能力Fig.4 Superoxide anion radical scavenging activity of vitamin C and BHT

2.3 米糠蛋白和米糠多肽對(duì)DPPH自由基的清除作用

圖5 米糠蛋白和米糠多肽對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.5 DPPH radical scavenging activity of rice bran protein and rice bran polypeptides

圖6 VC和BHT對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging activity of vitamin C and BHT

由圖5可知，米糠多肽較低質(zhì)量濃度下就對(duì)DPPH自由基具有清除能力，質(zhì)量濃度的增加對(duì)清除效果的變化不顯著；隨著不同分子質(zhì)量的米糠多肽質(zhì)量濃度的增加，清除率逐漸增高；隨著分子質(zhì)量的增加清除率呈下降的趨勢(shì)，Mw＜3kD的米糠多肽在高質(zhì)量濃度下DPPH自由基清除率最大為82.07%。不同質(zhì)量濃度不同分子質(zhì)量的米糠多肽對(duì)DPPH自由基清除率影響很大，可能與特定時(shí)間水解產(chǎn)生的活性片段的多少、長(zhǎng)度和序列等有關(guān)[20]。米糠蛋白的DPPH自由基清除率隨質(zhì)量濃度變化不大，最大值只有29.91%，進(jìn)一步證實(shí)DPPH自由基清除率可能與特定時(shí)間水解產(chǎn)生的活性片段的多少、長(zhǎng)度和序列等有關(guān)的這一說(shuō)法。由圖5、6對(duì)比可知，質(zhì)量濃度9.6mg/mL的Mw＜3kD的米糠多肽相當(dāng)于質(zhì)量濃度0.1mg/mL以上的VC和0.04mg/mL BHT對(duì)DPPH自由基的清除能力。

Mw＜3kD的米糠多肽對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，可能由于空間位阻決定反應(yīng)的傾向，小分子化合物由于更易接近自由基而擁有相對(duì)較高的抗氧化能力[21]。

2.4 Fe3+還原能力

圖7 VC對(duì)Fe3+還原能力Fig.7 Fe3+ reducing capacity of vitamin C

圖8 米糠蛋白和米糠多肽對(duì)Fe3+還原能力Fig.8 Fe3+ reducing capacity of rice bran protein and rice bran polypeptides

圖7 ～8給出了VC、米糠蛋白和不同分子質(zhì)量的米糠多肽的Fe3+還原能力，由于BHT在Fe3+還原體系反應(yīng)中會(huì)出現(xiàn)混濁，所以不做陽(yáng)性對(duì)比?？梢钥闯?，隨著反應(yīng)質(zhì)量濃度的增加，對(duì)Fe3+的還原能力也在增加，呈現(xiàn)一定的正相關(guān)關(guān)系。隨著米糠多肽分子質(zhì)量的增加，對(duì)Fe3+還原能力亦呈下降的趨勢(shì)。在最高質(zhì)量濃度條件下，Mw＜3kD的米糠多肽對(duì)Fe3+還原能力最高(A700nm=0.544)，其次是Mw為3～10kD的米糠多肽對(duì)Fe3+還原能力(A700nm=0.417)，再次是Mw＞10kD的米糠多肽對(duì)Fe3+還原能力(A700nm=0.365)。米糠蛋白在不同質(zhì)量濃度下對(duì)Fe3+還原能力的影響變化不大，在9.6mg/mL質(zhì)量濃度時(shí)具有最大還原力(A700nm=0.189)。圖7和圖8對(duì)比可知，質(zhì)量濃度9.6mg/mL的Mw＜3kD的米糠多肽相當(dāng)于質(zhì)量濃度0.1mg/mL以上的VC對(duì)Fe3+還原能力。

抗氧化劑的還原力與其抗氧化性之間存在聯(lián)系。抗氧化劑是通過(guò)自身的還原作用給出電子而清除自由基的，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)[22]。Mw＜3kD的米糠多肽具有較強(qiáng)的電子轉(zhuǎn)移能力。

2.5 ABTS+·清除能力

ABTS+·是抗氧化評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)常用自由基[23-24]。在研究抗氧化藥劑作用時(shí)用以評(píng)估藥劑捕捉自由基能力，而作為藥劑抗氧化能力的評(píng)價(jià)基準(zhǔn)。不同分子質(zhì)量的米糠多肽對(duì)ABTS+·的清除率能力見圖9。不同分子質(zhì)量的米糠多肽質(zhì)量濃度在0.3～0.6mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+·的清除能力較弱；隨著不同分子質(zhì)量的米糠多肽質(zhì)量濃度增加，清除率上升幅度較大；當(dāng)不同分子質(zhì)量的米糠多肽質(zhì)量濃度為9.6mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+·清除率達(dá)到最大；米糠多肽的分子質(zhì)量越大，清除能力越弱。在最高質(zhì)量濃度條件下，Mw＜3kD的米糠多肽對(duì)ABTS+·清除率最大為0.838mmol/L Trolox。米糠蛋白對(duì)ABTS+·清除率最大只達(dá)到0.367mmol/L Trolox，經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶酶解米糠蛋白制備的米糠多肽對(duì)ABTS+·清除率有很大提高。

圖9 米糠蛋白和米糠多肽對(duì)ABTS+·清除能力Fig.9 ABTS+· scavenging activity of rice bran protein and rice bran polypeptides

2.6 Fe3+螯合能力

過(guò)渡金屬如鐵、銅等可以誘導(dǎo)多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)而損害生物膜，產(chǎn)生毒性過(guò)氧化產(chǎn)物。Fe3+螯合能力與抗氧化性能有著密切的關(guān)系。由圖10可知，米糠蛋白和不同分子質(zhì)量的米糠多肽對(duì)Fe3+具有明顯的螯合能力；不同分子質(zhì)量的米糠多肽質(zhì)量濃度在0.3～4.8mg/mL時(shí)對(duì)Fe3+螯合能力變化并不明顯，質(zhì)量濃度在9.6mg/mL時(shí)對(duì)Fe3+螯合能力較強(qiáng)；米糠蛋白對(duì)Fe3+螯合能力同Mw＜3kD的米糠多肽對(duì)Fe3+螯合能力相當(dāng)，對(duì)Fe3+螯合能力最大的是Mw為3～10kD的米糠多肽。質(zhì)量濃度9.6mg/mL時(shí)Mw為3～10kD的米糠多肽對(duì)Fe3+螯合能力最大達(dá)到0.878mg/g，相當(dāng)于0.75mg/mL左右的VC和BHT對(duì)Fe3+螯合能力的量。

多羧基有機(jī)化合物具有較強(qiáng)金屬螯合能力[23]。米糠多肽對(duì)Fe3+的螯合能力可能與其中含有多羥基酚酸類化合物有關(guān)。中等分子質(zhì)量的米糠多肽主要產(chǎn)生多羥基酚酸類化合物以螯合金屬離子，屬于金屬離子螯合能力的抗氧化機(jī)制。

圖10 米糠蛋白和米糠多肽對(duì)Fe3+螯合能力Fig.10 Fe3+-chelating capacity of rice bran protein and rice bran polypeptides

3 結(jié) 論

本研究將米糠多肽超濾后分別獲得Mw＞10kD、Mw3～10kD、Mw＜3kD不同分子質(zhì)量的米糠多肽混合物組分，將它們與米糠蛋白、VC和BHT的抗氧化能力進(jìn)行對(duì)比，研究結(jié)果說(shuō)明，米糠多肽的抗氧化活性與蛋白分子質(zhì)量大小、質(zhì)量濃度等密切相關(guān)。

隨著不同分子質(zhì)量的米糠多肽的質(zhì)量濃度增加，抗氧化活性都有相應(yīng)程度的增加。高分子質(zhì)量的米糠多肽(Mw＞10kD)在高質(zhì)量濃度(9.6mg/mL)的條件下對(duì)·OH的清除能力最強(qiáng)，屬于具有活性氧自由基清除能力的抗氧化機(jī)制。Mw＜3kD的米糠多肽在高質(zhì)量濃度(9.6mg/mL)的條件下對(duì)·的清除能力、DPPH自由基的清除能力、ABTS+·清除率、Fe3+還原能力最大，屬于電子轉(zhuǎn)移(SET)的抗氧化機(jī)制。質(zhì)量濃度在9.6mg/mL時(shí)Mw為3～10kD的米糠多肽對(duì)Fe3+螯合能力最強(qiáng)，屬于金屬離子螯合能力的抗氧化機(jī)制。

在米糠活性肽應(yīng)用過(guò)程中，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況，選擇具有最佳效果的相應(yīng)質(zhì)量濃度及分子量肽段的米糠蛋白產(chǎn)品。

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