葉仕根，費(fèi)陽(yáng)春，李強(qiáng)，李華

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116023）

黃顙魚免疫球蛋白M基因的克隆與組織表達(dá)分析

葉仕根，費(fèi)陽(yáng)春，李強(qiáng)，李華

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116023）

根據(jù)GenBank中登錄的免疫球蛋白M(IgM）基因編碼氨基酸的保守序列以及魚類密碼子的偏好性設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，提取黃顙魚Peltebagrus fulvidraco脾臟總RNA，經(jīng)RT－PCR擴(kuò)增首次獲得了黃顙魚IgM的部分序列 (675 bp）。以β－actin為內(nèi)參基因，通過(guò)Real－time PCR法分析了黃顙魚IgM基因的組織分布特點(diǎn)。結(jié)果表明，在黃顙魚肝胰臟、脾臟、頭腎、中腎、鰓、肌肉、皮膚和腸道中均檢測(cè)到IgM基因的表達(dá)，頭腎和脾臟是IgM表達(dá)的主要部位，腎臟、鰓、皮膚、腸道和肝胰臟等組織中表達(dá)量居中，肌肉中表達(dá)量最低。經(jīng)鮰愛德華菌Edwardsiella ictaluri胞外產(chǎn)物免疫后，頭腎、脾臟和肝胰臟中IgM基因表達(dá)呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。

黃顙魚;IgM;克隆;組織分布

免疫球蛋白 (Immunoglobulins，Ig）是有頜類脊椎動(dòng)物所特有的介導(dǎo)體液免疫的重要效應(yīng)分子，在脊椎動(dòng)物特異性免疫系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用。Ig分子包括重鏈和輕鏈兩部分，根據(jù)重鏈恒定區(qū)化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，可將Ig劃分為多種類型。不同動(dòng)物所擁有的Ig種類不同，目前已報(bào)道的硬骨魚類Ig有IgM、IgD、IgZ/T和IgM－IgZ嵌合體等幾種類型［1－5］。有報(bào)道指出，病原菌感染可明顯提高鱖魚IgM的表達(dá)水平，而IgD和IgZ無(wú)明顯變化［6］，內(nèi)毒素刺激則可增加鯉IgM－IgZ嵌合體基因的轉(zhuǎn)錄［5］，這說(shuō)明不同類型的Ig有不同的免疫應(yīng)答機(jī)制。在這些Ig分子中，IgM存在于所有有頜類脊椎動(dòng)物中，其重鏈代表了從軟骨魚類到哺乳類的一個(gè)連續(xù)進(jìn)化的過(guò)程［7］。同時(shí)，IgM也是魚類最先表達(dá)的抗體，在體液免疫尤其是抵抗細(xì)菌性抗原侵?jǐn)_方面起著重要作用［8－9］。目前，已有多種魚類IgM重鏈基因被克隆鑒定，諸如模式魚類斑馬魚Danio rerio［10］和一些重要的經(jīng)濟(jì)魚類［11－17］。這些研究結(jié)果顯示，不同魚類的IgM重鏈之間存在基因數(shù)目差異和序列特異性，同時(shí)不同魚類IgM基因的組織分布也存在差異。

黃顙魚Peltebagrus fulvidraco是重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一，然而對(duì)其IgM基因的研究至今尚未見報(bào)道。本研究中，作者根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的黃顙魚近緣物種的IgM重鏈序列信息，通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物克隆IgM重鏈基因的部分片段，同時(shí)采用Real－time PCR方法研究黃顙魚IgM重鏈基因在各組織中的表達(dá)情況以及經(jīng)胞外產(chǎn)物 (OMPs）免疫刺激后的變化規(guī)律，以期為黃顙魚的抗感染機(jī)制和免疫防治技術(shù)研究提供理論依據(jù)，對(duì)了解魚類免疫應(yīng)答的分子機(jī)制以及免疫系統(tǒng)的起源與進(jìn)化等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用黃顙魚體質(zhì)量為35～50 g，購(gòu)自遼寧營(yíng)口某黃顙魚養(yǎng)殖場(chǎng)，馴養(yǎng)一周后用于試驗(yàn)。

Trizol總RNA提取試劑盒、M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶、熒光定量PCR試劑盒SYBR?Green SuperMix－UDG試劑盒等購(gòu)自上海 Invitrogen公司;pMD18－T載體、TaqDNA聚合酶、DNA Marker均購(gòu)自寶生物(大連）工程有限公司;引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 IgM重鏈基因核心序列的擴(kuò)增 黃顙魚暫養(yǎng)一周后，隨機(jī)挑選2尾，取其脾臟，按照試劑盒說(shuō)明書方法提取黃顙魚脾臟總RNA。選用經(jīng)電泳和紫外分析檢測(cè)條帶清晰、完整性好的RNA用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。取4 μL(約2 μg）總RNA懸液，使用M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶和oligo(dT）18于37℃下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA于－20℃下保存?zhèn)溆?。根?jù)NCBI中已登錄的魚類免疫球蛋白重鏈恒定 (CH）區(qū)氨基酸保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物［13］，正向引物 F'為 5'CCNACNCARACNGAYATHGAY 3'，反向引物R'為5'NYTNACNTGYTAYGTNAARGA 3'，其中N為G、A、T或C;Y為T或C;R為G或A，W為A或T。在此基礎(chǔ)上，參照魚類密碼子偏好性［18］對(duì)引物做進(jìn)一步修改，去掉一些魚類較少使用的密碼子，針對(duì)性地降低引物的簡(jiǎn)并度。修改后的正向引物IgM－F為5'CCAACCCAAACAGAMATAGAC 3'，反向引物IgM－R為5'TCTTTWACATAGCAAGTCAGG 3'，引物簡(jiǎn)并度由1 536、4 096下降至2。以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得目的條帶回收純化并與PMD－18T載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α中，經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定后，送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.2.2 序列分析 參照李穎等［19］的方法，將測(cè)序得到的序列在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）進(jìn)行相似性搜索和比對(duì)，并提交GenBank。采用Expasy網(wǎng)站的Prosite在線工具(http://prosite.expasy.org/prosite.html）進(jìn)行編碼蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域分析，用Clustal X1.8和DNA 6.0程序進(jìn)行氨基酸序列同源性分析和作圖。

1.2.3 IgM重鏈基因組織表達(dá)量的檢測(cè) 隨機(jī)選取3尾黃顙魚，分別取肝胰臟、脾臟、頭腎、腎臟、鰓、肌肉、皮膚和腸等8個(gè)組織，液氮速凍后按上述方法提取各組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)“1.2.1”和“1.2.2”節(jié)中獲得的IgM重鏈基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR引物，正向引物 IgM－F1為 5'AGAGCCAGAAGTGAGCATTA 3'，反向引物IgM－R1為5'CTTGGCAGGTGTATGTGG 3'。根據(jù)黃顙魚β－actin基因的序列 (GenBank登錄號(hào):EU161066.1）設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR內(nèi)參引物，正向引物 ACTIN－F為5'GATCCGGTATGTGCAAGGCT 3'，反向引物 ACTIN－R為 5'TGCCAGATCTTCTCCATATCA 3'(表1）。引物合成后，以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)E.B染色，用15 g/L瓊脂糖電泳檢驗(yàn)其特異性。

表1 基因克隆與組織表達(dá)分析所用引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in the gene cloning and tissue expression

熒光定量PCR參照劉俊等［20］的方法，并作適當(dāng)修改。采用2—△△CT法計(jì)算基因在各組織中的表達(dá)量:

其中:CT為樣品管中熒光強(qiáng)度達(dá)到特定閾值時(shí)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù);x表示8個(gè)待測(cè)組織中的任一組織;0表示8個(gè)待測(cè)組織中相對(duì)表達(dá)量最低的組織。用SYBR Green qPCR試劑盒，在Step one定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增。首先將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA模板以及引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，將CT值調(diào)整為20左右。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95℃下預(yù)變性2 min;95℃下變性30 s，62℃下退火30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品均進(jìn)行IgM和β－actin表達(dá)量的測(cè)定。每個(gè)樣本同時(shí)設(shè)立3個(gè)平行管，每次反應(yīng)均設(shè)置熔解曲線分析，以驗(yàn)證擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。反應(yīng)完成后，系統(tǒng)軟件將自動(dòng)給出每個(gè)樣本擴(kuò)增的IgM和β－actin基因的CT值，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行基因表達(dá)差異的分析。

1.2.4 鮰愛德華菌OMPs免疫對(duì)IgM基因表達(dá)的影響 取大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存的黃顙魚病原菌鮰愛德華菌A86，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，參照李強(qiáng)等［21］的方法提取OMPs。調(diào)整OMPs濃度為1 mg/mL，與弗氏完全佐劑等體積混合后腹腔注射免疫黃顙魚30尾 (100 μL/尾）。分別于免疫接種后第4、8、14、21和28天隨機(jī)選取3尾魚，取其肝胰臟、脾臟和頭腎組織，液氮速凍后按照上述方法提取各組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。另隨機(jī)選取3尾未免疫魚，取其肝臟、脾臟和頭腎組織作為免疫前對(duì)照。采用IgM－F1/R1進(jìn)行IgM基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增，ACTIN－F/R用作內(nèi)參基因擴(kuò)增引物，試驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)計(jì)算同“1.2.3”節(jié)。

2 結(jié)果

2.1 脾臟RNA質(zhì)量和定量PCR引物特異性驗(yàn)證

黃顙魚脾臟總RNA經(jīng)甲醛變性凝膠電泳分析，可見28S RNA和18S RNA兩條清晰條帶，亮度在2∶1左右，用核酸紫外分析儀檢測(cè)樣品的OD260nm/OD280nm值為1.8～2.0，表明RNA質(zhì)量較好，無(wú)蛋白質(zhì)、酚等污染(圖1）。對(duì)黃顙魚IgM基因表達(dá)分析引物IgM－F1/R1和內(nèi)參基因β－actin引物ACTIN－F/R擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析表明，均呈現(xiàn)單一峰值 (84.38、84.97℃），說(shuō)明PCR產(chǎn)物單一，無(wú)非特異性擴(kuò)增，引物特異性強(qiáng)(圖2）。

圖1 黃顙魚脾臟總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the total RNA in spleen of the yellow catfish

2.2 黃顙魚IgM重鏈基因恒定區(qū)的基因克隆

以脾臟總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以IgM－F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)得到一條約為700 bp且與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符的條帶 (圖3）。條帶經(jīng)切膠回收后連接pMD－18T載體，再經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切鑒定初步確認(rèn)后送交測(cè)序，最終獲得一段675 bp的序列并提交GenBank(GenBank登錄號(hào):JQ067604.1）。

2.3 黃顙魚IgM重鏈基因恒定區(qū)的序列分析

分析發(fā)現(xiàn)，黃顙魚IgM重鏈基因恒定區(qū)序列共編碼225個(gè)氨基酸殘基 (GenBank登錄號(hào):AEY79771），包含4個(gè)保守的半胱氨酸殘基 (圖4，第15、74、120、172位，加框表示）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，黃顙魚IgM重鏈基因恒定區(qū)第15、74、120、172位半胱氨酸殘基的分布符合IgC(免疫球蛋白恒定區(qū)）結(jié)構(gòu)域的特征(C－X(n）－C，X為任意氨基酸殘基），可分別形成兩個(gè)二硫鍵，組成兩個(gè)包含89個(gè)氨基酸殘基的 IgC結(jié)構(gòu)域 (圖4，第1～89位和第98～176位氨基酸殘基，下劃線表示）。經(jīng)Blast搜索和序列比對(duì)分析顯示，其編碼氨基酸與瓦式黃顙魚、大鰭鳠、斑點(diǎn)叉尾鮰、草魚和斑馬魚等魚類IgM重鏈基因編碼氨基酸序列的相似度為56% ～88%(表2，圖5），與魚類IgM基因具有較高同源性。

表2 黃顙魚IgM部分序列與其他魚類IgM氨基酸序列的一致性和相似度比較Tab.2 Similarity and identity of deduced amino acid sequence of IgM in yellow catfish Peltebagrus fulvidraco，with other fishes

2.4 黃顙魚IgM基因的組織表達(dá)

以β－actin為內(nèi)參基因，黃顙魚肝胰臟、脾臟、頭腎、腎臟、鰓、肌肉、皮膚和腸道等8個(gè)組織中IgM基因表達(dá)情況如圖6所示。從圖6可見，IgM基因在黃顙魚各檢測(cè)組織中均有表達(dá)，但各組織間的表達(dá)水平存在較大差異。各組織中表達(dá)量由高到低依次為頭腎、脾臟、腎臟、鰓、皮膚、腸道、肝胰臟和肌肉，頭腎和脾臟中IgM基因的表達(dá)量明顯高于其他組織，分別為表達(dá)量最低的肌肉組織的10.3和10.1倍;腎臟、鰓、皮膚、腸和肝胰臟中IgM基因的表達(dá)量居中，分別為肌肉組織的5.3、3.7、3.0、2.7和2.2倍。

2.5 OMPs免疫對(duì)黃顙魚IgM基因表達(dá)的影響

由于樣品保存不當(dāng) (從液氮取出時(shí)，裝有樣品的EP管因溫差過(guò)大炸裂），免疫前的黃顙魚肝胰臟、脾臟和頭腎組織樣品未能用于IgM基因表達(dá)的定量檢測(cè)。因此，各組織IgM基因表達(dá)變化情況均采用免疫后 (第4天）首次取樣為初始表達(dá)水平，并以此為基準(zhǔn)進(jìn)行比較。以β－actin為內(nèi)參基因，經(jīng)OMPs免疫后，黃顙魚肝胰臟、脾臟和頭腎組織 (使用專用凍存管保存于液氮中）IgM基因的表達(dá)情況如圖7所示。從圖7可見:黃顙魚肝胰臟、脾臟和頭腎中IgM基因的表達(dá)呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律，與脾臟和頭腎相比，肝胰臟中IgM基因表達(dá)在整個(gè)取樣過(guò)程中變化不太明顯，最高表達(dá)(免疫后第21天）和最低表達(dá) (第14天）分別為初始水平的1.06、0.81倍;3個(gè)組織中，頭腎和脾臟中IgM基因表達(dá)變化規(guī)律較為相似，均為短暫2.90和1.92～2.21倍。下降 (第8天）后再升高，最高表達(dá)分別出現(xiàn)在第14天和21天;脾臟IgM基因表達(dá)的最高值和最低值分別為初始水平的2.90和0.71倍，頭腎IgM基因表達(dá)的最高值和最低值分別為初始水平的2.21和0.82倍;脾臟和頭腎組織中IgM基因表達(dá)自免疫后第14天到第28天試驗(yàn)結(jié)束時(shí)均維持了較高的表達(dá)水平，分別為初始表達(dá)水平的1.84～

圖2 Real－time PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析Fig.2 Melting curves of the PCR products of IgM－F1/R1 and ACTIN－F/R

圖3 用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增黃顙魚IgM序列的PCR產(chǎn)物電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR products of IgM sequence by degenerate primers in yellow catfish

圖4 黃顙魚IgM部分序列編碼氨基酸的分析Fig.4 Deduced amino acid sequences by IgM from yellow catfish Peltebagrus fulvidraco

圖5 黃顙魚IgM部分序列與其他魚類IgM重鏈氨基酸序列的比較分析Fig.5 Comparison of multiple amino acid sequences of IgM in yellow catfish Peltebagrus fulvidraco，with other fishes

圖6 Real－time PCR檢測(cè)黃顙魚IgM基因的組織分布Fig.6 Expression levels of IgM gene in various tissues detected by Real－time PCR

圖7 OMPs免疫對(duì)黃顙魚各組織IgM表達(dá)的影響Fig.7 Expression levels of IgM gene in various tissues of yellow catfish challenged by OMPs detected by Real－time PCR

3 討論

本研究中，通過(guò)RT－PCR方法首次成功克隆了黃顙魚IgM重鏈基因恒定區(qū)部分cDNA序列。該序列編碼氨基酸中包含4個(gè)保守的半胱氨酸殘基，可分別形成兩個(gè)二硫鍵，組成兩個(gè)IgC(Ig恒定區(qū)）結(jié)構(gòu)域。同源性分析發(fā)現(xiàn)，其編碼氨基酸與瓦式黃顙魚、大鰭鳠、斑點(diǎn)叉尾鮰、草魚和斑馬魚等魚類的IgM重鏈基因編碼氨基酸序列的相似度為56%～88%，具有較高的同源性。在獲得黃顙魚IgM重鏈基因部分序列的基礎(chǔ)上，采用Real－time PCR方法檢測(cè)了IgM重鏈基因在黃顙魚不同組織中的表達(dá)情況以及經(jīng)OMPs免疫后其在各組織中表達(dá)的變化規(guī)律，為黃顙魚乃至其他魚類的抗感染機(jī)制和疾病防治研究等提供了理論依據(jù)。

在新基因的克隆中，根據(jù)近緣物種相關(guān)蛋白氨基酸序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物是常用的方法之一。但由于密碼子的簡(jiǎn)并性和搖擺性，常常使得設(shè)計(jì)出來(lái)的引物簡(jiǎn)并度非常高，不利于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。張曉峰等［18］研究發(fā)現(xiàn)，魚類密碼子與其他生物一樣具有明顯的偏好性，即編碼同一種氨基酸的密碼子在翻譯成蛋白質(zhì)時(shí)并非均一使用，通常是某些密碼子被優(yōu)先使用，某一物種或某一基因通常會(huì)傾向于使用一種或幾種特定的同義密碼子，即所謂的最優(yōu)密碼子，此現(xiàn)象被稱為密碼子偏性。本研究中，參照魚類密碼子偏好性對(duì)引物進(jìn)行了針對(duì)性修改，使兩條引物的簡(jiǎn)并度分別由1 536、4 096下降至2，提高了引物的擴(kuò)增效率，成功克隆到黃顙魚IgM基因重鏈恒定區(qū)的部分cDNA序列。

Real－time PCR分析表明，黃顙魚頭腎和脾臟是IgM基因mRNA的主要分布組織，其表達(dá)量顯著高于其他組織。本研究結(jié)果與李春濤等［22］對(duì)大鰭鳠以及王欣欣等［23］對(duì)草魚IgM基因mRNA分布情況的研究結(jié)果類似。胡瑜蘭［24］和彭博［25］研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚和鯽的頭腎中免疫球蛋白具有較高表達(dá)水平。頭腎和脾臟中較高的IgM基因mRNA或免疫球蛋白表達(dá)水平與其抗體產(chǎn)生細(xì)胞發(fā)生的主要器官的功能是相適應(yīng)的，這從側(cè)面證實(shí)了頭腎和脾臟是魚類免疫的主要場(chǎng)所［26－27］。值得注意是，作為魚類造血器官之一，黃顙魚腎臟中也有較高的IgM基因mRNA表達(dá)水平，為頭腎和脾臟的50%左右。但這與歐洲鰻鱺［16］和大鰭鳠［22］腎臟中IgM基因mRNA表達(dá)水平高于脾臟中的研究結(jié)果有一定差異。這可能與物種差異、動(dòng)物機(jī)體狀況、環(huán)境等因素有關(guān)，如季節(jié)變化會(huì)影響魚體內(nèi)免疫球蛋白的表達(dá)水平，夏季高于冬季;運(yùn)輸會(huì)影響斑點(diǎn)叉尾鮰對(duì)抗原刺激的應(yīng)答反應(yīng)［28－29］。上述結(jié)果表明，頭腎、脾臟和腎臟是魚類IgM基因mRNA和免疫球蛋白表達(dá)的主要場(chǎng)所。此外，本研究中還發(fā)現(xiàn)，黃顙魚肌肉組織中IgM基因mRNA的表達(dá)水平是所有被檢測(cè)組織中最低的，這與對(duì)歐洲鰻鱺的研究結(jié)果一致。肌肉組織中IgM低表達(dá)可能與肌肉組織中MHC表達(dá)量較低有關(guān)［30］。因?yàn)镸HC在免疫應(yīng)答的啟動(dòng)和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，肌肉組織中較低的MHC表達(dá)量使得其自身難以具備產(chǎn)生免疫反應(yīng)的分子基礎(chǔ)［31］。

由于樣本保存的原因，本研究中免疫前樣品未能用于IgM基因表達(dá)的定量分析。研究表明，鱖和大鰭鳠經(jīng)嗜水氣單胞菌滅活疫苗免疫后以及劍尾魚經(jīng)溶藻弧菌滅活疫苗免疫后，其IgM基因表達(dá)水平在第6～10天后顯著升高，但在前期如第3天 (劍尾魚）、第4天 (鱖）和第5天 (大鰭鳠）變化并不十分明顯［22，32－33］。因此，本研究中免疫后 (第4、8、14、21天）樣品中的IgM基因表達(dá)情況仍能反映出其變化規(guī)律。經(jīng)OMPs免疫后，黃顙魚脾臟和頭腎中IgM基因表達(dá)變化趨勢(shì)相似，均為先小幅降低 (第8天）后升高，且自第14天起維持在較高表達(dá)水平。這與嗜水氣單胞菌滅活疫苗免疫后，大鰭鳠脾臟和頭腎中IgM基因表達(dá)持續(xù)升高并維持在較高的表達(dá)水平的結(jié)果一致［22］。但與鱖經(jīng)嗜水氣單胞菌滅活疫苗免疫后，頭腎和脾臟中轉(zhuǎn)錄水平峰值出現(xiàn)在第7天，至第28天時(shí)鱖頭腎中轉(zhuǎn)錄水平下降到免疫前水平而脾臟仍維持在較高表達(dá)水平的研究結(jié)果有一定差異［33］。這可能與物種和取樣時(shí)間長(zhǎng)短有一定關(guān)系。Zilberg等［34］研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰注射鮰愛德華菌后，其血細(xì)胞、脾臟和頭腎中IgM基因表達(dá)量在13 d內(nèi)均顯著增加。Raida等［35］研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)虹鱒注射魯氏耶爾森氏菌Yersinia ruckeri后，其脾臟和頭腎中IgM基因表達(dá)量在21 d內(nèi)都有增加。這些結(jié)果表明，魚類IgM分子在3周內(nèi)可以識(shí)別細(xì)菌抗原［6］。盡管在未經(jīng)免疫刺激的情況下，肝胰臟中IgM基因表達(dá)水平較低 (僅為頭腎或脾臟的1/4左右），作為魚類重要的代謝器官，肝臟組成細(xì)胞參與肝臟免疫調(diào)節(jié)［36］，其仍然可能在免疫防御中發(fā)揮重要作用。然而，本研究結(jié)果表明，經(jīng)OMPs免疫后黃顙魚肝胰臟中IgM基因表達(dá)量無(wú)明顯變化。作者的另一研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鮰愛德華菌OMPs免疫可顯著提升黃顙魚肝胰臟中CAT、AKP和SOD活性 (另文發(fā)表）。這些結(jié)果表明，魚類特異性免疫防御更多的是與脾臟、頭腎等組織相關(guān)，肝胰臟更多的是通過(guò)增加一些免疫酶的活性來(lái)發(fā)揮免疫防御作用，主要參與機(jī)體的非特異性免疫防御，但其詳細(xì)機(jī)制仍有待于進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究中成功克隆到了黃顙魚IgM基因的部分序列，并檢測(cè)了其組織分布模式和經(jīng)OMPs免疫后的變化規(guī)律，研究結(jié)果將有助于對(duì)黃顙魚IgM結(jié)構(gòu)與功能的理解，為魚類的免疫防治技術(shù)和分子免疫應(yīng)答機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)資料。

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Molecular cloning and expression of partial IgM cDNA sequence in different tissues of yellow catfish Peltebagrus fulvidraco

YE Shi－gen，F(xiàn)EI Yang－chun，LI Qiang，LI Hua
(Key Laboratory of Mariculture＆ Stock Enhancement in North China's Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Partial cDNA sequence(675 base pairs）was cloned in total DNA of spleen in yellow catfishPeltebagrus fulvidracoby degenerated primers designed based on fish IgM heavy chain gene in GenBank and by RT－PCR.The expression of IgM gene in different tissues of the yellow catfish was studied by real time PCR with internal control β－actin.The results showed that the IgM gene was constitutively expressed in all detected tissues including hepatopancreas，spleen，head kidney，kidney，gill，skin，intestine and muscle，the maximal expression levels in spleen and head kidney，the minimal expression level in muscle，and the mid－level in the other tissues.There was a different expression pattern of the IgM gene in head kidney，spleen，and hepatopancreas in the yellow catfish challenged with ecto－products of Edwardsiella ictaluri.

Peltebagrus fulvidraco;immunoglobulin M;clone;tissue distribution

Q786

A

2013－03－13

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 (2011BAD13B03）

葉仕根 (1976－），男，副教授。E－mail:yedlsy@dlou.edu.cn通信作者:李華 (1958－），女，教授。E－mail:lihua@dlou.edu.cn

2095－1388(2013）06－0515－07