王勇朝 崔穎 崔建忠 張娟

鈣蛋白酶抑制劑對(duì)大鼠腦外傷后的神經(jīng)保護(hù)作用分析

王勇朝 崔穎 崔建忠 張娟

目的 分析鈣蛋白酶抑制劑對(duì)大鼠腦外傷后神經(jīng)的保護(hù)作用。方法 選取56只大鼠并進(jìn)行分組，腦外傷后分別注射鈣蛋白酶抑制劑和生理鹽水，分析細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 觀察組的神經(jīng)元凋亡比對(duì)照組少。結(jié)論 鈣蛋白酶抑制劑對(duì)腦外傷后的大鼠具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用。

鈣蛋白酶抑制劑；腦外傷大鼠；神經(jīng)保護(hù)；凋亡

腦外傷是一種由于間接或直接作用, 使腦部出現(xiàn)損傷的情況。比較常見的腦外傷有顱骨骨折、頭皮裂傷、顱內(nèi)血腫、腦震蕩等［1］。受傷后傷者會(huì)出現(xiàn)不同程度的意識(shí)模糊、嘔吐、頭痛、運(yùn)動(dòng)障礙等情況。顱腦損傷后腦細(xì)胞常出現(xiàn)凋亡的情況, 這與繼發(fā)性腦損傷的嚴(yán)重程度有密切關(guān)系。鈣蛋白酶作為腦外傷繼發(fā)性損傷中的重要組成因素之一, 通過激活caspase系統(tǒng)可能會(huì)對(duì)腦外傷繼發(fā)性損傷具有一定的保護(hù)作用。現(xiàn)采用大鼠實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取56只2～3個(gè)月大的健康SD大鼠作為研究對(duì)象, 所有大鼠的重量為255～290g之間, 其中雌性大鼠20例, 雄性大鼠26例。將其隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組, 每組28例。

1.2 方法 先給予所有大鼠注射250 mg/kg水合氯醛(10%),然后給予觀察組28例大鼠的側(cè)腦室注射10 μl鈣蛋白酶抑制劑, 給予對(duì)照組28例大鼠的側(cè)腦室注射10 μl生理鹽水。按照不同的處死時(shí)間點(diǎn)將每組各分為四個(gè)小組, 每小組為7例：0.5 h組、6 h組、24 h組以及3 d組。次日, 利用自由落體撞擊方式制造大鼠腦外傷(撞擊的高度為1.6 m,重量為55 g)。在各處死點(diǎn)觀察和記錄大鼠神經(jīng)功能的缺失癥狀。

1.3 TUNEL檢測(cè)法檢測(cè)凋亡 使用多聚甲醛(4%)和生理鹽水快速灌注大鼠, 然后將大鼠的整個(gè)腦組織取出, 并將軟腦膜剝離完全。將取出的腦組織侵泡于多聚甲醛(4%)中約4 h,然后再將其撈出侵泡于5℃的蔗糖溶液(30%)中約2 d時(shí)間［2］。將固定后的腦組織進(jìn)行冰凍切片(厚20 μm), 并在TUNEL試劑盒中進(jìn)行蘇木素染色。最后使用400倍的光鏡觀察并記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS11.5軟件, 數(shù)據(jù)使用均數(shù)( x-±s)表示, 并使用t檢驗(yàn), 以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示兩組大鼠的海馬區(qū)存在不同數(shù)量的TUNEL染色陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞。觀察組中, 0.5 h組為(54±2.9)個(gè)、6h組為(56±1.0)個(gè)、24h組為 (59±2.2)個(gè)、3d組為 (66±3.1)個(gè)；而對(duì)照組相中, 0.5h組為( 66±2.4)個(gè)、6h組為( 64±1.4)個(gè)、24h組為 (68±5.6)個(gè)、3d組為 (74±2.9)個(gè)?？梢? 觀察組的TUNEL陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞在不同的處死點(diǎn)均比對(duì)照組少, P＜0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

Calpain系統(tǒng)是一種比較復(fù)雜的蛋白降解體系, 其主要的作用對(duì)象是受體蛋白、蛋白激酶、細(xì)胞骨架蛋白。通過對(duì)其進(jìn)行降解, 從而將細(xì)胞分解, 使其引起凋亡。因此, Calpain的活化成為細(xì)胞凋亡的主要途徑。通過本次大鼠實(shí)驗(yàn)研究, 總結(jié)鈣蛋白酶誘發(fā)細(xì)胞凋亡的可能原因有以下兩點(diǎn)：①啟動(dòng)了Caspases介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；②Ca2+的釋出起到誘導(dǎo)死亡受體配體表達(dá)的作用。研究中, 給予觀察組腦損傷大鼠鈣蛋白酶抑制劑治療, 在大鼠腦外傷0.5 h能檢測(cè)到大鼠的凋亡細(xì)胞, 且凋亡細(xì)胞的數(shù)量呈逐漸上升的趨勢(shì), 在第3 d時(shí)達(dá)到高峰, 這也與其他文獻(xiàn)資料中的研究結(jié)果相一致。出現(xiàn)此種現(xiàn)象的原因可能是：使用鈣蛋白酶抑制劑治療大鼠屬于一次性注射治療, 在大鼠體內(nèi)的作用有限, 因此, 能在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到該藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響作用。為此, 推測(cè)3d后再進(jìn)行TUNEL法檢測(cè), 由于藥物在大鼠體內(nèi)的代謝降解作用, 濃度越來越小, 可能難以抑制鈣蛋白酶, 無法阻止細(xì)胞凋亡的進(jìn)度。不過對(duì)于具體的有效時(shí)間目前仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。通過本次研究, 證明鈣蛋白酶抑制劑對(duì)腦外傷后的大鼠具有一定的保護(hù)作用。從而能在一定程度上減少腦外傷后神經(jīng)細(xì)胞繼發(fā)性損傷, 這對(duì)于鈣蛋白酶抑制劑用于治療人類的腦外傷具有十分重要的意義。

［1］ 楊瑞,羅承良,孫玉霞,等.E64d對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷小鼠神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用.蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2011,31(2):183-187.

［2］ 丁可,王漢東,成慧琳,等.創(chuàng)傷性腦損傷后小鼠腸道Toll樣受體4的表達(dá).腸外與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng), 2010,17(04):243-246.

063000 唐山,河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(王勇朝張娟)；唐山市工人醫(yī)院神經(jīng)外科(崔穎 崔建忠)

高俊玲